腺病毒介導(dǎo)的心肌營(yíng)養(yǎng)素-1對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化作用及ERK分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:(1)探討CT-1(Cardiotrophin1)是否對(duì)hUCB-MSCs神經(jīng)分化具有促進(jìn)作用,尋找一種合適的細(xì)胞因子誘導(dǎo)hUCB-MSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,可能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病修復(fù)帶來(lái)希望;(2)研究MAPK/ERK信號(hào)分子在hUCB-MSCs神經(jīng)分化中的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:(1)分離、培養(yǎng)及鑒定hUCB-MSCs:收集人臍帶血標(biāo)本,用改良密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離臍血中單個(gè)核細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)變化并繪制生長(zhǎng)曲線,用流式

2、細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD29、CD44和CD105的表達(dá)。(2)病毒轉(zhuǎn)染:將Adv-CT-1及Adv-EGFP(腺病毒增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)分別轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs,于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h用免疫熒光染色檢測(cè)CT-1表達(dá)率,熒光顯微鏡下觀察CT-1和 EGFP轉(zhuǎn)染成功率。(3)神經(jīng)標(biāo)志物及凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè):免疫熒光分別檢測(cè)對(duì)照組、EGFP組、CT-1組及NIM組Nestin、NeuN及MBP神經(jīng)標(biāo)志物表達(dá);W

3、estern Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染CT-1組及對(duì)照組調(diào)亡相關(guān)蛋白bcl2、Bax、Bak等表達(dá)情況。(4)免疫共沉淀法(CO-IP)及Western Blot法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)hUCB-MSCs的CT-1受體(gp130和LIFRβ)及信號(hào)分子p-Raf-1、ERK1/2和p-ERK1/2表達(dá);加入MEK抑制劑后Western Blot法檢測(cè)Nestin、NeuN、MBP及p-ERK表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)hUCB-MSCs培養(yǎng)

4、及鑒定:原代細(xì)胞培養(yǎng)第5d可見(jiàn)多角形細(xì)胞和大量大而圓的破骨樣細(xì)胞及雜細(xì)胞,12 d后可見(jiàn)大量梭形細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng),平均28 d可以傳代。傳代后約12 h后細(xì)胞逐漸貼壁,細(xì)胞呈均一的梭形細(xì)胞,3-5 d可再次傳代, P3細(xì)胞得到形態(tài)均一,3-4d細(xì)胞融合率達(dá)90％。分離培養(yǎng)出hUCB-MSCs高表達(dá)間充質(zhì)相關(guān)抗原CD105(89.31%)、整合素家族CD29(98.41%)、細(xì)胞黏附分子CD44(99.20%)、不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志 CD

5、34。(2)腺病毒轉(zhuǎn)染:病毒轉(zhuǎn)染率隨著時(shí)間及 MOI的改變而變化,病毒 MOI為100PFU/細(xì)胞時(shí),在轉(zhuǎn)染72h,轉(zhuǎn)染效率較高(87.60±1.36%)且細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)方式與未感染細(xì)胞相同,為最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)。(3) CT-1對(duì)hUCB-MSCs神經(jīng)誘導(dǎo)分化作用:誘導(dǎo)6h后CT-1組及NIM組即呈類神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)改變,CT-1組變化更明顯;4組中,CT-1組Nestin陽(yáng)性率最高(86.82±4.29%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

6、;至第4d時(shí),各組Nestin表達(dá)明顯減少,CT-1組仍高于其他組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);誘導(dǎo)后6 h,CT-1組NeuN即有少量表達(dá)(14.26±2.20%),隨后逐漸升高,第4d時(shí)陽(yáng)性率達(dá)48.33±2.53%;CT-1組陽(yáng)性率均高于其他各組(P<0.05);誘導(dǎo)后6h,各組MBP均有少量表達(dá),隨后表達(dá)率逐漸升高,至第4d時(shí)陽(yáng)性率最高,CT-1組6h(14.12±2.16%)及4d(45.63±2.78%)時(shí)MBP陽(yáng)性率

7、均高于其他各組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CT-1對(duì) bax、bak及caspase3等凋亡相關(guān)蛋白影響:Western Blot結(jié)果顯示CT-1組bcl-2表達(dá)較對(duì)照組增加,CT-1組凋亡相關(guān)蛋白bax、bak、caspase3及caspase9表達(dá)(0.01±0.00,0.09±0.01,0.30±0.01,0.32±0.02)低于對(duì)照組(0.16±0.01,1.14±0.02,0.58±0.01,0.72±0.01),差異

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(4)不同時(shí)間點(diǎn)CT-1受體(gp130和LIFRβ)表達(dá)及ERK1/2、Raf-1磷酸化表達(dá):轉(zhuǎn)染后24小時(shí),hUCB-MSCs可見(jiàn)p-Raf-1、p-ERK1/2及gp130微弱表達(dá),未見(jiàn)LiFRβ表達(dá);48h見(jiàn)LiFRβ微弱表達(dá),p-Raf-1、p-ERK1/2及gp130表達(dá)增強(qiáng),與24h相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);72h時(shí),gp130/ LiFRβ及ERK1/2表達(dá)未見(jiàn)進(jìn)一步增強(qiáng);p-ERK

9、1/2和p-Raf-1表達(dá)仍繼續(xù)增加,與48h相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。加入不同濃度PD98059后ERK磷酸化、MBP、NeuN及Nestin水平變化:10 umol/L PD98059可使MBP、NeuN、Nestin及p-ERK表達(dá)減少(P<0.05);100 umol/L PD98059可使MBP、NeuN、Nestin及p-ERK表達(dá)明顯減少,與10 umol//L組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。