人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞及基因修飾的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血腦損傷(hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)是新生兒期腦損傷最為常見的疾病，是引起新生兒死亡、影響新生兒正常發(fā)育、導(dǎo)致兒童腦癱、精神發(fā)育遲滯、學(xué)習(xí)障礙和癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因。本病發(fā)病率較高，推測(cè)國(guó)內(nèi)每年約有750000新生兒發(fā)生窒息，約有25萬嬰兒因而成為傷殘兒和/或低智兒童(韓玉昆，1995)。盡管圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和對(duì)HIBD發(fā)病機(jī)制研究均取得很大發(fā)展，臨床上仍以對(duì)癥支持綜合治療為主而缺少特

2、異性的有效手段。因此為新生兒缺氧缺血腦損傷尋找新的治療途徑十分必要。 細(xì)胞移植和基因治療已成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性變的最有潛力的手段之一。然而這兩種治療方法目前仍存在許多有待解決的問題。傳統(tǒng)的細(xì)胞移植物來源于人的胎腦、胚胎神經(jīng)組織和神經(jīng)干細(xì)胞，這些移植物雖然可以定向分化為各類神經(jīng)細(xì)胞而發(fā)揮替代作用，但因取材困難、涉及倫理學(xué)爭(zhēng)議及免疫排斥等問題限制了應(yīng)用的空間(Bjorklund，2000)?；蛑委煹囊恍┹d體如腺病毒、逆

3、轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒也同樣存在使用的安全性、免疫排斥等問題(Somia，2001)。因此，選用何種細(xì)胞做為移植來源和基因載體是能否用于臨床的關(guān)鍵所在。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，起源于中胚層，主要位于成體骨髓，在臍血和外周血中也有少量的MSCs存在(Erice，2000；Goodwin，2004；Jeong，2004；Fernandez，1997)。MSCs具有強(qiáng)大的增殖能力，在體外長(zhǎng)期培

4、養(yǎng)過程中可以始終保持其多向分化潛能，在特定條件誘導(dǎo)下可以分化為各種組織細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌腱、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞(Owen,1998；Young，1998；Wakitani，1995；Dennis，1996；Azizi，1998；Kopen，1999；Sanchez-Ramos，2000；Brazelton，2000；Woodbury,2000)。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MSCs體內(nèi)移植可以有效改善腦缺血、創(chuàng)傷性腦損傷或帕

5、金森病腦損傷等大鼠模型的神經(jīng)功能(Chen，2000；Chen，2001；LiY,2001；MahmoodA，2001；許予明，2004)。MSCs用于移植具有以下的優(yōu)點(diǎn)：①具有貼壁生長(zhǎng)的特性易于在體外分離和擴(kuò)增；具有強(qiáng)大的增殖能力，足以滿足移植的需要；在適宜的條件下MSCs可在體外傳25代。1ml骨髓吸取物經(jīng)傳代后可產(chǎn)生幾十億個(gè)MSC(Colter，2000)。②可在體內(nèi)外表達(dá)多種治療性的外源目的基因(Chen，2000；HoCY，2

6、005)，被認(rèn)為是一種理想的基因治療中的靶細(xì)胞。③可以進(jìn)行自體移植，避免了免疫排斥問題。④除局部定位移植外，還可進(jìn)行系統(tǒng)移植如經(jīng)靜脈輸注(Li,2001；Yukinori，2002；Chen2001)，此移植方式便于今后應(yīng)用于臨床。 然而，取材于骨髓的MSCs同時(shí)也存在著應(yīng)用上的局限性：首先，骨髓MSCs的取材對(duì)供者仍可造成一定的損傷；其次，個(gè)體骨髓容易受到病原的侵襲尤其是皰疹病毒的感染；再次，隨年齡增長(zhǎng)骨髓細(xì)胞數(shù)量及其增殖和分

7、化潛能下降(D'Ippolito，1999；Rao，2001)等。因此，尋找新的MSCs來源很有必要。與人骨髓和外周血相比，源于臍血的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcordbloodmesenchymalstemcells，UCB-MSCs)所具備的來源豐富、易獲性、無創(chuàng)性、較少受病原體侵襲、可用于凍存等優(yōu)點(diǎn)，使其在近年來逐漸受到研究者的重視。而且，臍血免疫原性相對(duì)較弱，其內(nèi)淋巴細(xì)胞相對(duì)不成熟(TaylorS，1985；LuL，199

8、6)，還能用于HLA(humanleucocytesantigen，人類白細(xì)胞抗原)配型不符者之間輸注(Maitra，2004)。如果源于臍血的MSCs能在體外培養(yǎng)并建系，有望成為臨床上治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性病變的可行性方法。尤其針對(duì)于新生兒HIBD，由于骨髓采集存在一定困難，自體臍血取材的便利性、無創(chuàng)性、實(shí)用性等優(yōu)勢(shì)顯而易見。 然而迄今為止，對(duì)UCB-MSCs的研究目前仍處于初級(jí)探索階段，遠(yuǎn)不如骨髓MSCs被廣泛研究應(yīng)用

9、，其主要面臨的問題如下：①UCB-MSCs體外培養(yǎng)困難，從臍血中收獲MSCs的成功率遠(yuǎn)低于骨髓，文獻(xiàn)報(bào)道均未超過30％(Erices，2000；周敦華，2003；Bieback，2004)，足月兒產(chǎn)率更低為12.5％(Bieback，2004)，而骨髓MSCs一般在60％以上。所以體外培養(yǎng)所碰到的數(shù)量少、成功率低是UCB-MSCs用于研究首先面臨的一個(gè)重要問題。那么是什么因素影響了UCB-MSCs體外培養(yǎng)的成功率?其原因尚不清楚。②體外

10、誘導(dǎo)UCB-MSCs定向分化為神經(jīng)元的方法尚不成熟。與之相比，骨髓MSCs的定向誘導(dǎo)則比較成熟。雖然UCB-MSCs和骨髓MSCs兩者在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)性狀和多向分化潛能等方面有很多相似之處。但在向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的過程中，不同的誘導(dǎo)方法可能會(huì)出現(xiàn)不同的效果，如Jeong(2004)借鑒經(jīng)典的體外誘導(dǎo)骨髓MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的兩種方法分別是抗氧化劑的誘導(dǎo)方法和促進(jìn)胞漿內(nèi)cAMP升高的誘導(dǎo)方法用于UCB-MSCs，發(fā)現(xiàn)前種方法誘導(dǎo)后可快速

11、獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞；而后者幾乎不產(chǎn)生任何誘導(dǎo)效果。因此UCB-MSCs和骨髓MSCs的定向誘導(dǎo)分化方法是不可同日而語的，有必要進(jìn)一步探討。③提高M(jìn)SCs體內(nèi)移植后向神經(jīng)元方向的分化率為一難題。文獻(xiàn)報(bào)道移植后的骨髓MSCs僅有0.5％～1％分化為神經(jīng)元(LiY2001；LiY2002；ChenJ，2001)，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到移植治療的需要。UCB-MSCs在此領(lǐng)域的研究尚為空白。針對(duì)于新生兒科領(lǐng)域中的缺氧缺血性腦損傷的選擇性神經(jīng)元壞死的主要

12、病理特點(diǎn)，設(shè)想如能提高M(jìn)SCs在移植之后定植于腦組織局部經(jīng)腦內(nèi)環(huán)境的誘導(dǎo)后細(xì)胞中神經(jīng)元細(xì)胞的比例將更有利于發(fā)揮其真正意義上的替代性的治療作用。 綜上所述，本研究三部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜缦拢旱谝徊糠謴奶g、臍血采集量、臍血單個(gè)核細(xì)胞(mononuclearcells，MNCs)含量等數(shù)個(gè)方面來探討影響UCB-MSCs成功培養(yǎng)的相關(guān)因素，并在此基礎(chǔ)上探討其生物學(xué)特性，以期提高UCB-MSCs的培養(yǎng)成功率；第二部分尋找一種高效、細(xì)胞損傷小、適

13、于UCB-MSCs體外分化為神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)方法。第三部分構(gòu)建含有neurogenin1(神經(jīng)元素1，ngn1)真核表達(dá)質(zhì)粒，研究ngn1在模擬的體內(nèi)環(huán)境中對(duì)UCB-MSCs定向分化為神經(jīng)元的作用，以期提高M(jìn)SCs體內(nèi)移植后神經(jīng)元的分化率。 結(jié)論1.可以從臍血中分離獲得MSCs，具有與骨髓MSCs相似的形態(tài)學(xué)特征、增殖特征和免疫表型。臍血MNCs接種數(shù)量在1.25×108/L以上，可以提高培養(yǎng)的成功率。低胎齡者UCB-MS