IFN-DC分化相關(guān)信號(hào)通路初探.pdf

1、目的:研究JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在IFN-α促進(jìn)及加速單核細(xì)胞分化產(chǎn)生高度活化的、部分成熟的DC(IFN-DC)發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。
　　方法:采集正常供體動(dòng)員的外周造血干細(xì)胞(G-PBSC),Ficoll法分離獲得單個(gè)核細(xì)胞,采用磁珠分離獲得CD14+單核細(xì)胞,根據(jù)培養(yǎng)條件的不同分為三組,分別為CD14+單核細(xì)胞(對(duì)照組), CD14+單核細(xì)胞+800U/ml GM-CSF(GM-CSF組)和CD14+單核細(xì)胞+10

2、00 U/ml IFN-α2b+800U/ml GM-CSF(IFN-α2b+GM-CSF組)。進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):1. IFN-α2b+GM-CSF組和GM-CSF組分別于加入細(xì)胞因子0min、10min、30min、1h、2h、4h提取總蛋白,通過Western blot實(shí)驗(yàn),觀察兩組在不同時(shí)間點(diǎn)下相關(guān)信號(hào)蛋白(JAK1, p-JAK1, STAT1及p-STAT1)的表達(dá)情況;并檢測IFN-α2b+GM-CSF組和GM-CSF組分別加入

3、JAK-STAT信號(hào)通路阻斷劑(AG490)后相關(guān)信號(hào)蛋白的表達(dá)高峰是否減弱;2.以CD14+單核細(xì)胞CD80、CD86及CD83的表達(dá)水平作為基線水平,分別檢測IFN-α2b+GM-CSF組和GM-CSF組各培養(yǎng)三天后上述CD分子的表達(dá)水平,并檢測在以上兩組分別加入AG490各培養(yǎng)三天后上述CD分子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1. IFN-α2b+GM-CSF組培養(yǎng)三天后的IFN-DC表達(dá)DC較為特征性標(biāo)志,包括CD11c、CD86

4、、CD80、HLA-DR及CD209;CD83為DC的成熟標(biāo)志之一,在IFN-DC上部分表達(dá);同時(shí)在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)高表達(dá)的CD123,在IFN-DC亦高表達(dá);培養(yǎng)三天后的細(xì)胞形態(tài)上可見突起。2.Western blot檢測IFN-α2b+GM-CSF組在不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)蛋白表達(dá)顯示:JAK1和STAT1磷酸化水平在30min表達(dá)達(dá)到高峰,后逐漸減弱。予AG490干預(yù)后,JAK1和STAT1磷酸化水平在30min表達(dá)減弱。同時(shí)