七氟醚通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對幼年大鼠海馬不同亞區(qū)的不同損傷作用.pdf

1、目的：
　　七氟醚是一種經(jīng)典的吸入性麻醉藥，近年來由于其具有起效快，易復(fù)蘇以及麻醉深度易調(diào)控等特點，七氟醚被廣泛應(yīng)用于臨床手術(shù)麻醉。而且在老年人、中青年人以及兒童等各年齡段患者中均可適用，尤其在兒童全麻誘導(dǎo)及維持中有顯著優(yōu)點，因此兒童成為其重要的適用群體。
　　但是，眾所周知，到目前為止無論是靜脈麻醉藥還是吸入性麻醉藥，其作用機制都尚不明了。對于這樣一種作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，在方便手術(shù)操作的同時，他的安全性越來越成為人們

2、關(guān)注的焦點，特別是對幼年兒童的神經(jīng)發(fā)育是否有不利影響更是成為醫(yī)療工作者亟待解決的一個問題。早期對于吸入性麻醉藥的研究主要集中在其對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用上，有研究表明，七氟醚能夠促進大鼠腦缺血區(qū)的細胞存活，而且能夠減輕大腦再灌注損傷。還有學者認為，七氟醚預(yù)處理能夠減輕缺血缺氧對大鼠大腦的損害。這些都為七氟醚的臨床應(yīng)用安全性提供了支持。但是，已經(jīng)有越來越多的研究逐漸證實，七氟醚等吸入性麻醉藥存在一定程度的神經(jīng)毒性，并且對兒童認知能力的發(fā)育有著

3、不可忽視的影響。大量研究證實，七氟醚等吸入性麻醉藥能夠誘導(dǎo)小鼠大腦皮層及海馬等眾多腦區(qū)發(fā)生細胞凋亡，更重要的是，如果將幼年大鼠暴露于七氟醚后，其成年后的空間認知能力明顯低于正常小鼠。然而，吸入性麻醉藥造成神經(jīng)毒性的機制到目前為止也尚不明了。
　　有研究表明，吸入性麻醉藥神經(jīng)毒性的產(chǎn)生可能與其過度激活了γ氨基丁酸A型受體受體（GABAR）有關(guān)。最近有人提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能也是其神經(jīng)毒性的重要機制之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)一種重要的細胞器，他

4、對細胞的存活、蛋白合成、胞內(nèi)鈣平衡等眾多生理過程起著調(diào)節(jié)作用。一旦其功能紊亂會引發(fā)諸多疾病。當缺氧、鈣失衡、毒物刺激等損傷因素作用于細胞后，會誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而引起錯誤折疊的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)累積及鈣超載，最終引起細胞生理功能紊亂甚至凋亡。雖然之前的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與七氟醚引起的大腦細胞凋亡有關(guān)，然而經(jīng)歷七氟醚暴露的幼年大鼠海馬是否也會發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激？七氟醚引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠海馬不同類型的細胞中是否會造成不同的損傷？根據(jù)這一理論

5、是否可以研究出一種預(yù)防七氟醚神經(jīng)毒性的策略呢？因此，本課題圍繞上述這一系列問題展開了研究，目的是進一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在七氟醚對幼年大鼠海馬的損傷中作用，以及探討通過抑制麻醉過程中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用。
　　方法：
　　本實驗主要由三個部分組成，第一部分首先用七氟醚處理小鼠海馬神經(jīng)元來源的HT22細胞系，通過蛋白免疫印跡技術(shù)檢測細胞中BiP、p-IRE1等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標記蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑標記蛋白caspase

6、-12水平的變化，再利用流式細胞技術(shù)檢測處理后細胞凋亡率。第二部分是將3周齡大鼠暴露于七氟醚，通過蛋白免疫印跡技術(shù)檢測BiP、p-PERK等蛋白及caspase-12在海馬組織中的表達水平，再運用TUNEL染色法觀察其海馬腦片中凋亡細胞的分布，并利用免疫組織化學熒光雙標法檢測凋亡細胞的性質(zhì)。之后取七氟醚暴露后的大鼠海馬腦片利用膜片鉗技術(shù)檢測海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性變化，并在原代培養(yǎng)的大鼠海馬細胞中做鈣離子探針標記，觀察細胞內(nèi)游

7、離鈣離子濃度的變化。第三部分是在大鼠麻醉前給予腹腔注射4-PBA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，待5周后其生長到成年期做水迷宮測試，觀察抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對大鼠認知能力的保護作用。
　　結(jié)果：
　　實驗一：七氟醚暴露引起HT22細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究
　?。?）將細胞分為3組，對照組、處理組以及加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA組，在麻醉誘導(dǎo)箱中以2 vol％七氟醚處理5小時后收集細胞蛋白進行蛋白免疫印記檢測。結(jié)果顯示，處理組細胞中BiP、p

8、-IRE1以及活化的caspase-12水平比其余兩組均有顯著升高。4-PBA能顯著降低七氟醚引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平,Р<0.01。
　?。?）各組細胞進行七氟醚處理后立即收集細胞，利用流式細胞技術(shù)進行細胞凋亡的檢測。結(jié)果顯示，處理組的細胞凋亡率可高達9.4±0.13%，比對照組的1.52±0.60%顯著增高，而加4-PBA組凋亡率為3.93±0.42%。這證明抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效減少七氟醚引起的海馬細胞凋亡。
　　實驗二：七

9、氟醚對幼年大鼠海馬不同亞區(qū)的影響
　　（1）將三周齡的幼年SD大鼠隨機分為對照組、處理組以及加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA組。在麻醉誘導(dǎo)箱中以2 vol%七氟醚處理5小時并復(fù)蘇2小時后收取大腦海馬組織蛋白樣品以及灌注切腦片。海馬組織蛋白樣品進行蛋白免疫印記檢測。結(jié)果顯示，處理組樣品中BiP、p-PERK以及活化的caspase-12水平比對照組有顯著升高，而加4-PBA后，這幾個蛋白水平均有所下降Р<0.01。
　?。?）各組

10、大鼠海馬腦片進行TUNEL染色，發(fā)現(xiàn)處理組有明顯的細胞凋亡現(xiàn)象，而且凋亡細胞主要集中在齒狀回區(qū)，CA1-CA3區(qū)幾乎無細胞凋亡，加4-PBA組的凋亡細胞數(shù)明顯低于處理組。
　?。?）各組大鼠海馬腦片進行活化的caspase-12與NeuN免疫熒光雙標染色，結(jié)果顯示二者基本重合，且活化的caspase-12的表達變化與蛋白免疫印記結(jié)果相一致，證明七氟醚處理后主要是神經(jīng)元發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而非膠質(zhì)細胞。
　?。?）各組大鼠海馬腦

11、片進行TUNEL與Ki67免疫熒光雙標，結(jié)果顯示齒狀回區(qū)的凋亡細胞中有部分與Ki67陽性細胞相重合，證明七氟醚誘導(dǎo)的凋亡細胞中有部分未分化成熟的神經(jīng)干細胞。
　?。?）3周齡大鼠如上述分組并處理后取新鮮海馬腦片進行膜片鉗電生理記錄，檢測海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性。結(jié)果顯示處理組中CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的平均放電個數(shù)和放點頻率均顯著降低，加4-PBA組這些數(shù)據(jù)卻明顯回升。證明七氟醚使海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性顯著降低了。

12、
　　（6）原代培養(yǎng)除齒狀回以外的海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)一周后如上述進行七氟醚處理，然后在無鈣緩沖液中做Fluo-3鈣離子探針染色，實驗發(fā)現(xiàn)，處理組海馬神經(jīng)元內(nèi)細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度明顯高于對照組和加4-PBA組 P<0.01。
　　實驗三：幼年期的七氟醚暴露對大鼠成年后認知能力的影響
　?。?）3周齡SD大鼠如上述隨機分組并處理，將其正常飼養(yǎng)至2月齡，進行水迷宮空間記憶能力測試，訓(xùn)練四天，結(jié)果在四天的訓(xùn)練過程中，各組大鼠找到逃

13、生平臺的時間均逐漸減少。而從第三天開始，處理組大鼠的逃脫時間明顯長于其余兩組。
　?。?）訓(xùn)練4天后，第五天進行水迷空間探索實驗，結(jié)果無論是在目標象限停留時間還是穿越平臺區(qū)的次數(shù)，處理組均低于其余兩組。加4-PBA組與對照組之間無顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　本實驗證明了七氟醚能夠通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對海馬神經(jīng)元造成毒性損傷，其創(chuàng)新點在于發(fā)現(xiàn)這種損傷作用在海馬不同亞區(qū)所引起的結(jié)果是不同的，而且如在七氟醚麻醉前給予4-PB

14、A抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效降低這種損傷作用并緩解其造成的成年后認知能力受損。這進一步闡明了七氟醚神經(jīng)毒性的重要機制，并對臨床防治這一副作用起到了指導(dǎo)作用。
　　（1）離體和在體實驗均證明七氟醚可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　（2）七氟醚通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成海馬齒狀回發(fā)生細胞凋亡，而在CA1-CA3卻無細胞凋亡現(xiàn)象。
　?。?）七氟醚暴露引起海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元內(nèi)在興奮性的降低，這一作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣耗