七氟醚通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)幼年大鼠海馬不同亞區(qū)的不同損傷作用.pdf

1、目的：
　　七氟醚是一種經(jīng)典的吸入性麻醉藥，近年來(lái)由于其具有起效快，易復(fù)蘇以及麻醉深度易調(diào)控等特點(diǎn)，七氟醚被廣泛應(yīng)用于臨床手術(shù)麻醉。而且在老年人、中青年人以及兒童等各年齡段患者中均可適用，尤其在兒童全麻誘導(dǎo)及維持中有顯著優(yōu)點(diǎn)，因此兒童成為其重要的適用群體。
　　但是，眾所周知，到目前為止無(wú)論是靜脈麻醉藥還是吸入性麻醉藥，其作用機(jī)制都尚不明了。對(duì)于這樣一種作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，在方便手術(shù)操作的同時(shí)，他的安全性越來(lái)越成為人們

2、關(guān)注的焦點(diǎn)，特別是對(duì)幼年兒童的神經(jīng)發(fā)育是否有不利影響更是成為醫(yī)療工作者亟待解決的一個(gè)問(wèn)題。早期對(duì)于吸入性麻醉藥的研究主要集中在其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用上，有研究表明，七氟醚能夠促進(jìn)大鼠腦缺血區(qū)的細(xì)胞存活，而且能夠減輕大腦再灌注損傷。還有學(xué)者認(rèn)為，七氟醚預(yù)處理能夠減輕缺血缺氧對(duì)大鼠大腦的損害。這些都為七氟醚的臨床應(yīng)用安全性提供了支持。但是，已經(jīng)有越來(lái)越多的研究逐漸證實(shí)，七氟醚等吸入性麻醉藥存在一定程度的神經(jīng)毒性，并且對(duì)兒童認(rèn)知能力的發(fā)育有著

3、不可忽視的影響。大量研究證實(shí)，七氟醚等吸入性麻醉藥能夠誘導(dǎo)小鼠大腦皮層及海馬等眾多腦區(qū)發(fā)生細(xì)胞凋亡，更重要的是，如果將幼年大鼠暴露于七氟醚后，其成年后的空間認(rèn)知能力明顯低于正常小鼠。然而，吸入性麻醉藥造成神經(jīng)毒性的機(jī)制到目前為止也尚不明了。
　　有研究表明，吸入性麻醉藥神經(jīng)毒性的產(chǎn)生可能與其過(guò)度激活了γ氨基丁酸A型受體受體（GABAR）有關(guān)。最近有人提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能也是其神經(jīng)毒性的重要機(jī)制之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的細(xì)胞器，他

4、對(duì)細(xì)胞的存活、蛋白合成、胞內(nèi)鈣平衡等眾多生理過(guò)程起著調(diào)節(jié)作用。一旦其功能紊亂會(huì)引發(fā)諸多疾病。當(dāng)缺氧、鈣失衡、毒物刺激等損傷因素作用于細(xì)胞后，會(huì)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而引起錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)累積及鈣超載，最終引起細(xì)胞生理功能紊亂甚至凋亡。雖然之前的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與七氟醚引起的大腦細(xì)胞凋亡有關(guān)，然而經(jīng)歷七氟醚暴露的幼年大鼠海馬是否也會(huì)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激？七氟醚引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠海馬不同類(lèi)型的細(xì)胞中是否會(huì)造成不同的損傷？根據(jù)這一理論

5、是否可以研究出一種預(yù)防七氟醚神經(jīng)毒性的策略呢？因此，本課題圍繞上述這一系列問(wèn)題展開(kāi)了研究，目的是進(jìn)一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在七氟醚對(duì)幼年大鼠海馬的損傷中作用，以及探討通過(guò)抑制麻醉過(guò)程中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)主要由三個(gè)部分組成，第一部分首先用七氟醚處理小鼠海馬神經(jīng)元來(lái)源的HT22細(xì)胞系，通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中BiP、p-IRE1等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑標(biāo)記蛋白caspase

6、-12水平的變化，再利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)處理后細(xì)胞凋亡率。第二部分是將3周齡大鼠暴露于七氟醚，通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)BiP、p-PERK等蛋白及caspase-12在海馬組織中的表達(dá)水平，再運(yùn)用TUNEL染色法觀(guān)察其海馬腦片中凋亡細(xì)胞的分布，并利用免疫組織化學(xué)熒光雙標(biāo)法檢測(cè)凋亡細(xì)胞的性質(zhì)。之后取七氟醚暴露后的大鼠海馬腦片利用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性變化，并在原代培養(yǎng)的大鼠海馬細(xì)胞中做鈣離子探針標(biāo)記，觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)游

7、離鈣離子濃度的變化。第三部分是在大鼠麻醉前給予腹腔注射4-PBA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，待5周后其生長(zhǎng)到成年期做水迷宮測(cè)試，觀(guān)察抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)大鼠認(rèn)知能力的保護(hù)作用。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一：七氟醚暴露引起HT22細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究
　?。?）將細(xì)胞分為3組，對(duì)照組、處理組以及加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA組，在麻醉誘導(dǎo)箱中以2 vol％七氟醚處理5小時(shí)后收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行蛋白免疫印記檢測(cè)。結(jié)果顯示，處理組細(xì)胞中BiP、p

8、-IRE1以及活化的caspase-12水平比其余兩組均有顯著升高。4-PBA能顯著降低七氟醚引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平,Р<0.01。
　?。?）各組細(xì)胞進(jìn)行七氟醚處理后立即收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。結(jié)果顯示，處理組的細(xì)胞凋亡率可高達(dá)9.4±0.13%，比對(duì)照組的1.52±0.60%顯著增高，而加4-PBA組凋亡率為3.93±0.42%。這證明抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效減少七氟醚引起的海馬細(xì)胞凋亡。
　　實(shí)驗(yàn)二：七

9、氟醚對(duì)幼年大鼠海馬不同亞區(qū)的影響
　　（1）將三周齡的幼年SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、處理組以及加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA組。在麻醉誘導(dǎo)箱中以2 vol%七氟醚處理5小時(shí)并復(fù)蘇2小時(shí)后收取大腦海馬組織蛋白樣品以及灌注切腦片。海馬組織蛋白樣品進(jìn)行蛋白免疫印記檢測(cè)。結(jié)果顯示，處理組樣品中BiP、p-PERK以及活化的caspase-12水平比對(duì)照組有顯著升高，而加4-PBA后，這幾個(gè)蛋白水平均有所下降Р<0.01。
　?。?）各組

10、大鼠海馬腦片進(jìn)行TUNEL染色，發(fā)現(xiàn)處理組有明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而且凋亡細(xì)胞主要集中在齒狀回區(qū)，CA1-CA3區(qū)幾乎無(wú)細(xì)胞凋亡，加4-PBA組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于處理組。
　　（3）各組大鼠海馬腦片進(jìn)行活化的caspase-12與NeuN免疫熒光雙標(biāo)染色，結(jié)果顯示二者基本重合，且活化的caspase-12的表達(dá)變化與蛋白免疫印記結(jié)果相一致，證明七氟醚處理后主要是神經(jīng)元發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而非膠質(zhì)細(xì)胞。
　?。?）各組大鼠海馬腦

11、片進(jìn)行TUNEL與Ki67免疫熒光雙標(biāo)，結(jié)果顯示齒狀回區(qū)的凋亡細(xì)胞中有部分與Ki67陽(yáng)性細(xì)胞相重合，證明七氟醚誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞中有部分未分化成熟的神經(jīng)干細(xì)胞。
　?。?）3周齡大鼠如上述分組并處理后取新鮮海馬腦片進(jìn)行膜片鉗電生理記錄，檢測(cè)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性。結(jié)果顯示處理組中CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的平均放電個(gè)數(shù)和放點(diǎn)頻率均顯著降低，加4-PBA組這些數(shù)據(jù)卻明顯回升。證明七氟醚使海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性顯著降低了。

12、
　?。?）原代培養(yǎng)除齒狀回以外的海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)一周后如上述進(jìn)行七氟醚處理，然后在無(wú)鈣緩沖液中做Fluo-3鈣離子探針染色，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處理組海馬神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度明顯高于對(duì)照組和加4-PBA組 P<0.01。
　　實(shí)驗(yàn)三：幼年期的七氟醚暴露對(duì)大鼠成年后認(rèn)知能力的影響
　　（1）3周齡SD大鼠如上述隨機(jī)分組并處理，將其正常飼養(yǎng)至2月齡，進(jìn)行水迷宮空間記憶能力測(cè)試，訓(xùn)練四天，結(jié)果在四天的訓(xùn)練過(guò)程中，各組大鼠找到逃

13、生平臺(tái)的時(shí)間均逐漸減少。而從第三天開(kāi)始，處理組大鼠的逃脫時(shí)間明顯長(zhǎng)于其余兩組。
　?。?）訓(xùn)練4天后，第五天進(jìn)行水迷空間探索實(shí)驗(yàn)，結(jié)果無(wú)論是在目標(biāo)象限停留時(shí)間還是穿越平臺(tái)區(qū)的次數(shù)，處理組均低于其余兩組。加4-PBA組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)證明了七氟醚能夠通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)海馬神經(jīng)元造成毒性損傷，其創(chuàng)新點(diǎn)在于發(fā)現(xiàn)這種損傷作用在海馬不同亞區(qū)所引起的結(jié)果是不同的，而且如在七氟醚麻醉前給予4-PB

14、A抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效降低這種損傷作用并緩解其造成的成年后認(rèn)知能力受損。這進(jìn)一步闡明了七氟醚神經(jīng)毒性的重要機(jī)制，并對(duì)臨床防治這一副作用起到了指導(dǎo)作用。
　?。?）離體和在體實(shí)驗(yàn)均證明七氟醚可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　?。?）七氟醚通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成海馬齒狀回發(fā)生細(xì)胞凋亡，而在CA1-CA3卻無(wú)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
　?。?）七氟醚暴露引起海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元內(nèi)在興奮性的降低，這一作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣耗