替米沙坦改善大鼠慢性胰腺炎的作用及機(jī)制探討.pdf

1、慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是一種多因素共同參與的炎癥過程，胰腺小葉內(nèi)或小葉間纖維組織大量增生累及胰腺實(shí)質(zhì)和胰管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胰腺內(nèi)外分泌功能受損，其特征是胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells，PSCs)活化，合成并釋放大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，引起胰腺組織進(jìn)行性纖維化。許多分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了PSCs的激活和功能調(diào)節(jié)，包括過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(pero

2、xisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和Smads蛋白途徑，它們的刺激物分別是PPAR-γ配體、血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggrowth factor-β1，TGF-β1)等，其中TGF-β1是PSCs活化和

3、細(xì)胞外基質(zhì)合成的主要刺激物，是CP進(jìn)展中的重要細(xì)胞因子。
　　 過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)屬核激素受體家族的成員，是通過配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，包括PPAR-α、PPAR-β、PPAR-δ和PPAR-γ，其中PPAR-γ是PPARs中研究最為廣泛的一種亞型，在調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答、脂質(zhì)合成、糖代謝以及各種細(xì)胞的分化、增殖和凋亡途徑中發(fā)揮重要

4、作用，其中PPARγ通過抑制炎癥應(yīng)答基因的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用的。研究發(fā)現(xiàn)，無論是發(fā)病早期還是進(jìn)展期，PPAR-γ激動劑曲格列酮能夠抑制CP進(jìn)程中TGF-β1誘導(dǎo)的胰腺星狀細(xì)胞(Pancreatic Stellate Cells，PSCs)的活化，阻止纖維化進(jìn)程。
　　 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是一種經(jīng)典的循環(huán)激素系統(tǒng)，主要通過生理性血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生對血壓、體液和電解質(zhì)平衡

5、發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)已證實(shí)許多組織和臟器存在各自具有活性的RAS產(chǎn)物，并通過旁分泌和自分泌的方式特異性調(diào)節(jié)各臟器的功能。胰腺局部同樣存在RAS，它在胰腺的生理和病理生理過程中發(fā)揮重要作用，其生物功能是通過AngⅡ1型和2型受體(angiotensinⅡtype1 receptor and type2 receptor，AT1R and AT2R)來介導(dǎo)的，其中大多數(shù)是通過AT1R介導(dǎo)的，激活的血管緊張素Ⅱ與AT1R介導(dǎo)氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)炎

6、癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和組織纖維化。關(guān)于AT2R的作用，目前研究尚不深入。在正常生理狀態(tài)下，AngⅡ與AT-2R結(jié)合，介導(dǎo)血管收縮、降低腎小管對鈉的重吸收，改善上皮細(xì)胞功能，抑制細(xì)胞生長和結(jié)締組織沉積，AT-2R的這些效應(yīng)是通過調(diào)節(jié)受體表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。在應(yīng)激狀態(tài)下，血管緊張素受體拮抗劑(Angiotensin receptor blockers，ARB)通過AngⅡ抑制AT-1R的激活，反饋性促進(jìn)AngⅡ的合成并激活A(yù)T-2R。應(yīng)激時(shí)，AT-2R

7、在胰腺、心臟、腎臟、腦、腎上腺和脈管系統(tǒng)呈現(xiàn)表達(dá)，發(fā)揮上述作用，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡。最近有文獻(xiàn)報(bào)道：與攜帶野生型AT-2R基因的CP小鼠比較，AT-2R基因敲出小鼠CP胰腺纖維化程度減輕，表明AT-2R具有抗纖維化作用。
　　 RAS阻斷的最基本效應(yīng)是抗炎癥反應(yīng)，可能有助于阻止胰腺炎癥和糖尿病的進(jìn)展。有研究顯示，在WBN/Kob大鼠自發(fā)性慢性胰腺炎模型中，坎地沙坦，一種AT1R拮抗劑，通過抑制TGF-β1的過表達(dá)，阻止PSCs

8、的激活，改善CP的炎癥和纖維化程度。與野生型相比，在雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠CP模型中，AT1R缺陷小鼠胰腺纖維化和PSCs激活的程度明顯降低，TGF-β1 mRNA水平也較低，提示AT1R途徑在PSCs活化、增殖所致的胰腺纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。
　　 替米沙坦是一種AT1R拮抗劑，能夠阻斷AT1R，并部分激動PPAR-γ，這種雙重作用在理論上更有利于抑制慢性炎癥和纖維化的進(jìn)展。有研究報(bào)道，Tel通過降低磷脂酰肌醇(-3)激酶(ph

9、osphatidylinositol-3 kinase，P13K)活性，抑制(纖)絲狀肌動蛋白(filamentous actin，F(xiàn)-actin)的形成和細(xì)胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule3，ICAM3)的易位，最終抑制趨化因子誘導(dǎo)的CD4陽性淋巴細(xì)胞遷移。Tel的這一作用是通過PPAR-γ、而不依賴于AT1R，提示Tel抗炎作用的發(fā)揮有賴于PPAR-γ。同樣也是體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tel通過激活

10、PPAR-γ抑制AT1R基因的表達(dá)，這種對血管緊張素Ⅱ功能的雙重抑制，有助于更完全地抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)，為CP的治療提供了更好的手段。本研究將探討Tel改善大鼠CP的作用及其機(jī)制，為CP的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 內(nèi)容：
　　 第一部分建立慢性胰腺炎大鼠模型
　　 目的:建立CP大鼠模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物干預(yù)，并觀察大鼠CP病變形成過程中α-SMA和PPAR-γ蛋白表達(dá)的變化。
　　 方法:經(jīng)

11、大鼠尾靜脈一次性注射二丁基二氯基錫(dinbutyltin dichloride，DBTC)，按體重值隨機(jī)分為模型組，包括1天組、3天組、5天組、1周組、2周組、6周組，模型對照組大鼠尾靜脈注射有機(jī)溶劑，通過HE染色了解組織學(xué)改變，Sirius Red染色后應(yīng)用圖像定量分析系統(tǒng)測定膠原含量，全自動生化儀測血淀粉酶(amylase，AMS)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(alka

12、line phosphatase，ALP)，分光光度儀測定胰腺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性。Envision免疫組化半定量方法測定α-SMA和PPAR-γ蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論:根據(jù)組織學(xué)評分各項(xiàng)指標(biāo)、Sirius Red染色膠原含量和胰腺組織髓過氧化物酶MPO活性測定的動態(tài)變化確定大鼠CP模型的建立。根據(jù)α-SMA蛋白表達(dá)，判斷PSCs激活的時(shí)間和程度，為藥物干預(yù)時(shí)間點(diǎn)的選擇提供依據(jù)；隨著大

13、鼠CP的病程進(jìn)展，PPAR-γ蛋白表達(dá)漸增強(qiáng)，與病情呈正相關(guān)。
　　 第二部分替米沙坦改善大鼠慢性胰腺炎的作用機(jī)制探討
　　 目的:將大鼠隨機(jī)分為正常對照組、正常+Tel(8.33mg/kg)組、CP組、CP+早期大劑量Tel組、CP+早期小劑量Tel組、CP+晚期大劑量Tel組、CP+晚期小劑量Tel組，觀察Tel對大鼠CP的作用，其中早期是指造模的同時(shí)給予Tel，晚期是指造模2周后給予Tel，大劑量是指8.33mg/

14、kg，小劑量是指4.17mg/kg。觀察替米沙坦對大鼠慢性胰腺炎的影響，并探討其機(jī)制。
　　 方法:HE染色了解各組組織學(xué)評分變化，Sirius Red染色后應(yīng)用圖像定量分析系統(tǒng)測定膠原含量，分光光度儀測定各組胰腺組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，放免法測各組血清胰島素(insulin，INS)水平。Envision免疫組化半定量方法測定各組α-SMA、PPAR-γ、AT1R和AT2R蛋白的表達(dá)，

15、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction，RT-PCR)測定各組TGF-β1和PPAR-γ在RNA水平的表達(dá)。
　　 結(jié)論:在造模同時(shí)以及造模2周后給予大劑量Tel，均能夠改善大鼠胰腺炎癥和纖維化程度。其機(jī)制可能與下調(diào)AT1R、減少TGF-β1的產(chǎn)生和PSCs的激活相關(guān)；Tel在體內(nèi)對PPAR-γ的影響，不是通過增加它在蛋白和RNA水平的表達(dá)，可能通過