香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞C-Kit-可溶性干細(xì)胞因子交互作用受損及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:肺微血管內(nèi)皮損傷和細(xì)胞凋亡是COPD/肺氣腫發(fā)病的重要機(jī)制之一。目前認(rèn)為損傷內(nèi)皮的修復(fù)主要機(jī)制是在各種促內(nèi)皮修復(fù)和血管發(fā)生因子作用下局部血管內(nèi)皮細(xì)胞和循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)定向遷移和增殖的過程。煙草煙霧暴露引起外周血中EPCs數(shù)量減少。因?yàn)楣撬鐴PCs動員能力影響外周血中EPCs數(shù)量，我們推測在煙草煙霧暴露的引起的COPD/肺氣腫發(fā)病過程中可能存在有與骨髓EPCs動員相

2、關(guān)的c-Kit/可溶性干細(xì)胞因子(soluble stem cell factor, s-SCF)相互作用減弱的現(xiàn)象。
　　目的:本研究利用腹腔注射香煙提取物(Cigarette Smoking Extract，CSE)構(gòu)建小鼠肺氣腫模型，觀察經(jīng)腹腔暴露CSE誘導(dǎo)的肺氣腫小鼠骨髓中EPCs動員相關(guān)的c-Kit/s-SCF交互作用水平(即骨髓c-Kit(+)EPCs數(shù)量和s-SCF濃度）是否存在變化;如果證實(shí)骨髓c-Kit(+)EP

3、Cs數(shù)量和s-SCF存在變化，我們將進(jìn)一步研究這些變化所涉及的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:1.香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型中骨髓c-Kit+內(nèi)皮祖細(xì)胞和可溶性干細(xì)胞因子變化:24只4～6周齡的雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對照組及CSE（每組12只），分別在實(shí)驗(yàn)第0、11及22天定時(shí)定量腹腔注射CSE溶液/PBS溶液，第7天收集骨髓標(biāo)本（每組6只），第28天測定小鼠氣道阻力和動態(tài)肺順應(yīng)性后收集肺組織標(biāo)本和骨髓標(biāo)本。肺組織病理切片蘇

4、木素-伊紅（HE）染色后觀察形態(tài)學(xué)改變并定量測定平均肺泡隔厚度(MAST)、平均內(nèi)襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI)。免疫印跡和實(shí)時(shí)定量PCR測定小鼠肺組織c-Kit蛋白和mRNA表達(dá)。骨髓細(xì)胞經(jīng)紅細(xì)胞裂解后經(jīng)流式細(xì)胞儀測定EPCs和c-Kit(+)EPCs水平，ELISA測定骨髓沖洗液上清液s-SCF濃度。
　　2.香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型中可溶性干細(xì)胞因子減少機(jī)制初探:明膠酶譜法測定小鼠骨髓沖洗液上清MMP-9活性，化

5、學(xué)法測定小鼠骨髓沖洗液上清NO濃度，ELISA法測定小鼠骨髓沖洗液上清MMP-9和TIMP-1濃度。免疫印跡法測定小鼠骨髓細(xì)胞SCF、MMP-9、TIMP-1和NOS3蛋白水平。實(shí)時(shí)定量PCR測定小鼠骨髓組織SCF及MMP-9mRNA表達(dá)。
　　3.香煙提取物對體外培養(yǎng)的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和凋亡及其c-Kit+細(xì)胞亞群構(gòu)成的影響:采用密度梯度離心法分離小鼠骨髓EPCs并培養(yǎng);通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、對培養(yǎng)第7天的貼壁細(xì)胞行DiI-

6、acLDL攝取及FITC-UEA-I結(jié)合雙染鑒定及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物，綜合鑒定EPCs。分別以0.5％、1％及2％CSE干預(yù)培養(yǎng)7天的小鼠EPCs，采用噻唑藍(lán)比色法(MTT法)檢測EPCs增殖能力，采用AnnexinⅤ-FICT/PI雙染法檢測EPCs凋亡。測定1％CSE對培養(yǎng)7天的小鼠的EPCs NO分泌及NOS3表達(dá)的影響，測定1％CSE對培養(yǎng)7天的小鼠EPCs c-Kit表達(dá)和c-Kit亞群的影響。
　　結(jié)果:1.

7、香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型中骨髓c-Kit+內(nèi)皮祖細(xì)胞和可溶性干細(xì)胞因子變化:實(shí)驗(yàn)第28天，模型組和對照組的Raw和 Cdyn分別是(2.15±0.27) cmH2O/ml·sec vs(1.13±0.09)cmH2O/ml·sec,(32.65±2.87)μL/cmH2O vs(52.51±1.90)μL/cmH2O，P均＜0.05。與對照組相比，模型組肺實(shí)質(zhì)破壞明顯、肺泡壁變薄、部分肺泡破裂和肺泡腔擴(kuò)大，肺氣腫形成;模型組平均內(nèi)襯

8、間隔(MLI)和肺泡破壞指數(shù)(DI)顯著增高，而平均肺泡隔厚度(MAST)顯著降低，P均＜0.05。對照組和模型組的肺組織c-Kit蛋白相對表達(dá)分別是(0.59±0.090) vs(0.39±0.09)，P＜0.05。模型組和對照組肺組織c-Kit mRNA相對表達(dá)分別為(0.07±0.01) vs(0.10±0.02)，模型組肺是對照組的-1.43倍，P＜0.05。對照組與模型組第28天的右脛骨骨髓經(jīng)紅細(xì)胞裂解后的非紅細(xì)胞數(shù)分別是(9

9、.44×106)±(1.82×106)vs(9.03×106)±(1.72×106)，P＞0.05; EPCs和c-Kit(+)EPCs分別占非紅細(xì)胞的(6.92±1.35)％vs(3.99±0.49)％，(4.73±0.63)％vs(3.09±0.37)％，P均＜0.05;對照組和模型組第7天和第28天骨髓沖洗液上清液s-SCF濃度分別是(36.83±7.86) pg/mL vs(27.52±6.30) pg/mL、(32.59±8.

10、97) pg/mL vs(14.67±1.18) pg/mL，P均＜0.05。
　　2.香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型中可溶性干細(xì)胞因子減少機(jī)制初探:盡管模型組小鼠骨髓沖洗液上清液MMP-9活性第7天無明顯變化(P＞0.05)，但是第28天活性顯著降低(P＜0.05);對照組和模型組第7天和第28天小鼠骨髓沖洗液上清液NO濃度分別是(7.34±1.41)μmol/mL vs(10.34±3.52)μmol/mL(P＜0.05)、(7

11、.96±1.19)μmol/mL vs(6.86±1.37)μmol/mL(P＞0.05);對照組與模型組第7天和第28天小鼠骨髓沖洗液上清液MMP-9濃度分別是(4.93±0.57)ng/mL vs(7.62±1.41)ng/mL(P＜0.005)、(5.36±0.68)ng/mL vs(4.99±0.62)ng/mL(P＞0.05);對照組與模型組第7天和第28天小鼠骨髓沖洗液上清液TIMP-1濃度分別是(335.77±66.12)

12、pg/mL vs(527.96±82.01)pg/mL、(322.67±54.31)pg/mLvs(597.54±90.57)pg/mL，P均＜0.01;對照組與模型組第7天和第28天小鼠骨髓沖洗液上清液中MMP-9/TIMP-1分別是(14.81±3.74) vs(15.09±2.95)(P＞0.05)，(17.18±4.69) vs(8.59±2.23)(P＜0.005);對照組與模型組小鼠第7天骨髓細(xì)胞SCF、MMP-9、TIMP

13、-1及NOS3蛋白相對表達(dá)分別是(0.73±0.08) vs(0.41±0.07)、(0.53±0.11) vs(0.80±0.15)、(0.52±0.09) vs(0.79±0.12)及(0.61±0.07) vs(0.73±0.05)，P均＜0.05;對照組與模型組小鼠第28天骨髓細(xì)胞SCF、MMP-9、TIMP-1及NOS3蛋白相對表達(dá)分別是(0.75±0.09)vs(0.39±0.17)(P＜0.05)、(0.59±0.10)和

14、(0.57±0.13)(P＞0.05)、(0.54±0.05) vs(0.83±0.09)(P＜0.05)、(0.60±0.06) vs(0.26±0.03)(P＜0.05);對照組與模型組7天和第28天小鼠骨髓細(xì)胞SCF mRNA相對表達(dá)分別是[(6.58×10-4)±(2.51×10-4)] vs[(3.13×10-4)±(1.76×10-4)]和[(6.46×10-4)±(2.50×10-4)] vs[(3.29×10-4)±(2

15、.02×10-4)]，P均＜0.05;對照組與模型組7天和第28天小鼠骨髓細(xì)胞MMP-9mRNA相對表達(dá)分別是(0.13±0.02) vs(0.20±0.06)(P＜0.05)、(0.14±0.04) vs(0.14±0.03)(P＞0.05)。
　　3.香煙提取物對體外培養(yǎng)的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和凋亡及其c-Kit+細(xì)胞亞群構(gòu)成的影響:培養(yǎng)7天的小鼠EPCs呈梭形、紡錘形或多邊形，可形成首尾相連網(wǎng)狀血管樣結(jié)構(gòu)，亦可呈鋪路石樣外觀，

16、其DiI-acLDL攝取及FITC-UEA-I結(jié)合雙染陽性率為(94.67±4.16)％，其特異性表面抗原CD34+CD133+Flk-1+細(xì)胞占（95.07±1.73）％;0％、0.5％ CSE、1％ CSE及2％ CSE干預(yù)培養(yǎng)的EPCs后，MTT法測定的OD450分別是(0.197±0.014)、(0.138±0.007)、(0.106±0.007)及(0.047±0.006)，AnnexinⅤ-FICT/PI雙染法測定的凋亡率分

17、別是(16.754±1.396)％、(39.660±2.906)％、(52.320±3.372)％及(74.313±6.522)％，P均＜0.01。對照組和1％ CSE干預(yù)組EPCs培養(yǎng)上清液NO濃度分別是(38.89±4.27)umol/L vs(13.47±2.18)umol/L，P＜0.005;對照組和1％ CSE干預(yù)組培養(yǎng)細(xì)胞中c-Kit+亞群分別為(48.30±3.82) vs(50.29±3.45)，P＞0.05;對照組和1

18、％ CSE干預(yù)組培養(yǎng)細(xì)胞中NOS3和c-Kit蛋白的相對表達(dá)分別是(0.614±0.060) vs(0.235±0.049)及(0.709±0.018) vs(0.376±0.053)，P均＜0.005。
　　結(jié)論:1.在腹腔注射CSE所致的小鼠肺氣腫中骨髓EPCs動員依賴的c-Kit/s-SCF交互作用受損。
　　2.骨髓SCF蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)及MMP-9酶活性降低促成骨髓s-SCF濃度降低，骨髓MMP-9活性降低與