毒素清顆粒對家兔內(nèi)毒素肺損傷的保護作用.pdf

1、本文研究目的：采用一次性靜脈注射內(nèi)毒素復制肺損傷模型，觀察細胞因子和炎癥介質(zhì)在內(nèi)毒素肺損傷中的變化，探討內(nèi)毒素介導的肺損傷病理生理學機制，并進一步揭示毒素清顆粒對內(nèi)毒素肺損傷保護作用的分子生物學機制，為臨床應用提供依據(jù)。 研究方法：健康雄性日本大耳白兔36只(n=36)，隨機分為空白對照組、模型組、毒素清大劑量組、毒素清中劑量組、毒素清小劑量組，雙黃連對照組。各組6只。實驗前1天、造模前2h及造模后30min，空白對照組和模型組

2、分別灌胃同等體積的生理鹽水，用藥組分別灌胃毒素清(5.04g·kg-1·d-1、2.52g·kg-1·d-1、1.26g·kg-1·d-1)、雙黃連(2.8ml·kg-1·d-1)。內(nèi)毒素肺損傷模型采用一次性耳緣靜脈注射精制大腸桿菌內(nèi)毒素(60μg/Kg)。造模后5小時取材。觀察家兔一般狀態(tài)、呼吸頻率，心率變化；發(fā)熱效應；外周血中中性粒細胞、白細胞計數(shù)；采用放射免疫法測定外周血清中細胞因子腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfact

3、or，TNF)-α、白細胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)、IL-6(Interleukin-6，IL-6)及IL-8(Interleukin-8，IL-8)水平以及支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid，BALF)中TNF-α、分泌型免疫球蛋白(Secretoryimmunoglobulin，sIgA)水平；采用黃嘌磷氧化酶法和TBA(硫代巴比妥酸)法分別測定肺泡灌洗液中超氧化物歧化酶(

4、SuperoxideDismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的水平；光鏡下觀察肺組織形態(tài)學改變；采用免疫組織化學技術(shù)檢測肺組織中巨噬細胞、細胞間黏附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)、血管細胞粘附分子-1(Vascularcelladhesionmolecule-1，VCAM-1)、IL-1和TNF-a的表達水平；采用原位雜交技術(shù)檢測巨噬細胞炎癥

5、蛋白-2(Macrophageinflammatoryprotein-2mRNA，MIP-2mRNA)表達水平。 研究結(jié)果：(1)靜注內(nèi)毒素后，模型組，毒素清組以及雙黃連對照組家兔體溫皆有上升，模型組最高，其最大發(fā)熱高度(△T)和體溫反應指數(shù)(TemperatureResponseIndex，TRI)與空白對照組相比顯著增加(P＜0.01)。毒素清中劑量組△T、TRI與模型組相比有顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。

6、 (2)模型組家兔在60、180、300min的心率(Heartrate，HR)呈進行性上升，呼吸頻率(Respiratoryrate，RR)增快，在60min處達高峰。模型組與基礎值和空白對照組同時點比較有顯著差異。與模型組同時點相比，毒素清組及雙黃連組在各時點均可不同程度的逆轉(zhuǎn)HR和RR的上升。而毒素清組和雙黃連組相比無顯著性差異。 (3)模型組外周血白細胞(Whitebloodcell，WBC)和中性粒細胞(Polymor

7、phonuclearleukocytes，PMN)計數(shù)在60min處開始明顯降低，與空白對照組同時點相比差異顯著(P＜0.01)，且恢復緩慢，在實驗5h仍低于實驗前水平。毒素清組、雙黃連組計數(shù)變化趨勢介于空白對照組和模型組之間，能明顯逆轉(zhuǎn)WBC和PMN進行性下降，而且毒素清大、中劑量組在實驗后5h接近實驗前的水平。 (4)與空白組相比，模型組肺含水量顯著增加(P＜0.05)，外周血清中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8水平

8、顯著升高(P＜0.01)，BALF中TNF-α和MDA水平升高(P＜0.01)、sIgA水平降低(P＜0.01)，而毒素清組均能逆轉(zhuǎn)各項指標，大劑量和中劑量組作用更顯著。 (5)肺組織病理形態(tài)學觀察可見，模型組家兔肺組織可見炎癥呈彌漫性的，支氣管周圍伴有大量炎癥細胞浸潤，管腔堵塞肺實變，肺泡隔增寬，肺間質(zhì)水腫，可見較多白細胞浸潤，局限性肺不張，毛細血管擴張充血。毒素清組家兔肺部炎癥反應明顯減輕。 (6)免疫組化結(jié)果顯示，

9、模型組CD68陽性細胞主要表達在肺血管、小支氣管周圍，肺泡及間質(zhì)散在出現(xiàn)。與空白對照組相比，模型組表達呈強陽性(P＜0.01)，毒素清各劑量組，雙黃連組與模型組相比表達顯著減低(P＜0.01，P＜0.05)。毒素清高劑量組較雙黃連組顯著降低(P＜0.05)。 TNF-α免疫組化結(jié)果顯示，模型組以單核巨噬細胞的陽性表達為主，較空白對照組表達明顯增強，(P＜0.01)，經(jīng)毒素清干預后，其表達較模型組明顯減弱(P＜0.01)，且毒素清

10、中劑量組較高劑量組和低劑量組有明顯差異(P＜0.05，P＜0.01)，與雙黃連組相比無顯著性差異(P＞0.05)。 IL-1陽性反應產(chǎn)物主要表達在細胞漿內(nèi)，模型組主要表達在支氣管上皮細胞，肺血管內(nèi)皮細胞的胞漿內(nèi)，呈強陽性。毒素清大劑量組，中劑量組較模型組表達顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。毒素清低劑量組和雙黃連組與模型組相比無顯著性差異。 ICAM-1免疫組化結(jié)果顯示，模型組家兔肺組織ICAM-1主要表達在支氣管

11、上皮細胞，血管內(nèi)皮細胞，較空白對照組表達顯著增強(P＜0.01)。毒素清各劑量組以及雙黃連組都較模型組表達顯著減低，高、中劑量組較雙黃連組表現(xiàn)明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，中劑量組較低劑量組明顯降低(P＜0.05)。 VCAM-1免疫組化結(jié)果顯示，模型組家兔肺組織中VCAM-1主要表達在肺血管內(nèi)皮細胞，支氣管上皮細胞，都呈強陽性，在肺間質(zhì)也有大量表達。模型組較空白對照自表達顯著增強，毒素清組和雙黃連組ICAM-1表達都

12、顯著減低，毒素清中劑量組與低劑量組相比顯著降低(P＜0.05)。 (7)原位雜交結(jié)果顯示，在模型組家兔肺組織中，可見位于肺小動、靜脈及細支氣管周圍，疏松結(jié)締組織內(nèi)的巨噬細胞MIP-2mRNA表達陽性，定量結(jié)果顯示，模型組較空白對照組MIP-2mRNA表達顯著增強(P＜0.01)，毒素清大劑量組、小劑量組和中劑量組，較模型組表達顯著減低(P＜0.05，P＜0.01)，毒素清中劑量較小劑量MIP-2mRNA表達顯著減低(P＜0.05

13、)，且毒素清中劑量作用較好。 研究結(jié)論： (1)通過一次性靜脈注射內(nèi)毒素可以成功復制大耳白兔的肺損傷模型，表現(xiàn)為家兔外周血炎性細胞急劇下降、肺含水量增加、肺臟病理損傷嚴重，其發(fā)生機制可能為肺組織中ICAM-1和VCAM-1的表達上調(diào)，PMN和血管內(nèi)皮細胞(Vascularendothelialcell，VEC)粘附增加，促進了PMN在肺內(nèi)的集聚、扣押，進而過度釋放炎性介質(zhì)和自由基。 (2)毒素清顆粒能夠?qū)箖?nèi)毒素