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1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br> 探討 MAPKs(絲裂原活化蛋白激酶)在鈦顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成中的作用,并通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的siRNA干擾p38的表達(dá),觀察sip38對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和骨溶解的影響及可能機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)方法:
1.體外實(shí)驗(yàn)中,采用鈦顆粒懸液(0.1mg/ml)刺激原代破骨細(xì)胞前體細(xì)胞,通過(guò)TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色、Western Blot觀察鈦顆粒對(duì)破骨細(xì)胞成熟分化及相關(guān)蛋白TRAP的影響,并通
2、過(guò)Western Blot檢測(cè)MAPKs(p38 MAPK,ERK,JNK)信號(hào)通路的激活情況。
2.通過(guò)Western Blot、免疫熒光等檢測(cè)經(jīng)腺病毒介導(dǎo)的sip38干擾后各組破骨細(xì)胞相關(guān)蛋白 TRAP的表達(dá),以及抗酒石酸酸性磷酸酶染色鑒定成熟破骨細(xì)胞,并通過(guò)PCR檢測(cè)干擾p38后相關(guān)基因NFATc1、c-fos的變化.
3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,構(gòu)建小鼠顱骨顆粒誘導(dǎo)骨溶解模型,通過(guò)H&E染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色及免疫
3、組化等,觀察不同處理組顱骨骨溶解及破骨細(xì)胞數(shù)目變化情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1.鈦顆??赏ㄟ^(guò)激活p38 MAPK、JNK信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化成熟,并且p38 MAPK的激活更加明顯。
2.通過(guò)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞并干擾p38的表達(dá)及磷酸化,觀察到sip38可通過(guò)降低c-fos、NFATc1基因的表達(dá),從而抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化成熟和特異性TRAP蛋白的表達(dá)。
3.成功建立鈦顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨
4、骨溶解模型,通過(guò) siRNA干擾p38的表達(dá)及激活后,破骨細(xì)胞數(shù)目及顆粒誘導(dǎo)的顱骨骨溶解明顯減少。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
本課題證明鈦顆??赏ㄟ^(guò)p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化成熟,通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的小干擾RNA沉默p38可抑制p38 MAPK信號(hào)通路的激活,從而降低調(diào)控破骨細(xì)胞分化成熟的相關(guān)基因 NFATc1及 c-fos的表達(dá),抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的成熟分化。局部注射sip38可有效減少鈦顆粒誘導(dǎo)的小
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