慢病毒介導的RNA干擾RPMI-8226細胞MIC-1表達抑制破骨細胞成熟的實驗研究.pdf

1、[背景]
　　多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種惡性漿細胞增生性腫瘤,占血液系統(tǒng)腫瘤的13％,目前仍是一種無法治愈的疾病。MM的主要臨床表現(xiàn)為骨痛和溶骨性損害,即骨髓瘤骨病(MBD)。而MBD的效應細胞為破骨細胞(OC)。OC為一類具有骨吸收能力的多核巨細胞,來源于單核/巨噬細胞系,定位于骨髓中。在MM,骨髓微環(huán)境因骨髓瘤細胞浸潤骨髓而發(fā)生改變,OC前體細胞接受到不正常的信號刺激而過度分化成熟,從而造成骨質(zhì)破壞。巨噬細胞抑制因子1(MIC

2、-1)是人轉(zhuǎn)化因子β超家族成員,生物學功能復雜多樣,在MM患者骨髓液中可檢測到異常高表達,可能是OC新的促進因子,參與MBD的發(fā)病過程。
　　[目的]
　　探討靶向抑制RPMI-8226細胞MIC-1表達對與其共培養(yǎng)的OC分化成熟的影響。
　　[方法]
　　1.通過密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞(PBMNC),將其放入Transwell小室中的下室,在巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和細胞核因子-кB受體

3、活化因子配體(RANKL)體系下與上室的RPMI-8226細胞進行共培養(yǎng),并設(shè)立PBMNC單獨培養(yǎng)為對照組。用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,甲苯胺藍染色法檢測牙本質(zhì)片的骨吸收陷窩情況及分析陷窩面積,流式細胞儀檢測CD51/CD61表達情況分析比較兩組OC成熟情況。
　　2.實時熒光定量PCR檢測各細胞株中MIC-1表達情況。通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術(shù)體外擴增MIC-1cDNA片段后與酶切、純化后的表達載體

4、GV115連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒EGFP-MIC-1-FLAG并進行PCR及測序鑒定,最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細胞中,利用熒光顯微鏡和Westernblot進行表達鑒定。
　　3.設(shè)計并合成五條MIC-1siRNA靶點序列,并分別連入酶切好的RNAi慢病毒載體GV143。將各連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細菌感受態(tài)細胞,并進行PCR及測序鑒定。然后分別與表達載體EGFP-MIC-1-FLAG共轉(zhuǎn)染293T細胞,采用Westernblot方法篩

5、選最佳靶點。將含有最佳干擾靶點的轉(zhuǎn)移載體及包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒,組成三質(zhì)粒包裝系統(tǒng),共轉(zhuǎn)染293T細胞,培養(yǎng)48h后,收集并濃縮慢病毒液,測定慢病毒滴度。將不同復感染指數(shù)(MOI=0,5,10)慢病毒液感染RPMI-8226細胞,實時熒光定量PCR檢測病毒敲減效率。
　　4.密度梯度法分離人PBMNC并將其放入Transwell小室中的下室,將第三部分中慢病毒感染后的RPMI-8226細胞放入上室進行誘導培養(yǎng)。用TRAP染色,甲

6、苯胺藍染色法檢測牙本質(zhì)片的骨吸收陷窩情況及分析陷窩面積,流式細胞儀檢測CD51/CD61表達情況分析OC分化成熟情況。
　　[結(jié)果]
　　1.在與RPMI-8226細胞共培養(yǎng)后,與對照組比較,可見較多多核巨細胞,TRAP染色見胞漿內(nèi)有較多紫紅色顆粒,見3個至數(shù)十個不等的淡藍色胞核,核仁明顯,牙本質(zhì)片甲苯胺藍染色后可見明顯增多藍色骨吸收陷窩,流式細胞儀檢測CD51/CD61表達量達53.88%,較對照組增多,兩組間有顯著統(tǒng)計學

7、差異(p<0.05)。
　　2.實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)RPMI-8226細胞高表達MIC-1。應用RT-PCR在體外擴增出MIC-1全長,片段大小為946bp,與預期相符。同時測序亦證實,MIC-1基因已被成功插入真核表達載體。將已測序成功的含MIC-1基因的真核表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞后,細胞內(nèi)可見明顯熒光。Westernblot結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的293T細胞可檢測到大小約63kDa的EGFP-MIC-1-FLAG融

8、合蛋白表達,說明轉(zhuǎn)染成功,目的基因可在真核細胞內(nèi)穩(wěn)定表達。
　　3.構(gòu)建及合成五條MIC-1siRNA靶點序列,與已酶切成功的慢病毒載體連接,PCR鑒定和測序證實均連接成功。將前部分已構(gòu)建成功的融合基因表達載體及各重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞后,WesternBlot結(jié)果顯示MIC-1基因被特異性抑制,且在過表達質(zhì)粒與慢病毒干擾質(zhì)粒比例為4:1及2:1時,MIC-1-RNAi(shRNA1)靶點對目的基因的抑制效果最好。成功包裝和濃

9、縮了慢病毒顆粒,經(jīng)熒光法測定病毒滴度為1×109TU/ml。將收獲的慢病毒轉(zhuǎn)染RPMI-8226細胞后,CCK-8法檢測慢病毒感染對細胞活力無影響,熒光顯微鏡下觀察細胞熒光,感染效率可達80%以上。實時熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示RPMI-8226細胞MIC-1mRNA表達明顯下降,驗證敲減效率達75%以上。
　　4.PBMNC與慢病毒感染RPMI-8226細胞共培養(yǎng)后,與空病毒組相比較,慢病毒感染組多核巨細胞

10、TRAP染色陽性多核細胞數(shù)減少,TRAP活性顯著降低,牙本質(zhì)片骨吸收陷窩明顯減少,流式細胞術(shù)檢測CD51/CD61表達量降低,兩組間的差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　[結(jié)論]
　　1.RPMI-8226細胞與PBMNC共培養(yǎng)后可促進其向OC分化成熟。說明此種共培養(yǎng)體系建立成功,此方法可在體外模擬骨髓瘤微環(huán)境,對體外研究MM中OC分化成熟機制及調(diào)節(jié)因素提供了簡潔有效的方法。
　　2.成功構(gòu)建MIC-1融合基因表達