XIAP在肝癌組織的異常表達及對肝癌細胞調控的研究.pdf

1、肝癌，作為世界上第五種常見的惡性腫瘤，高居癌癥致死原因中的第三位，占據成人肝臟惡性腫瘤的80％]。它的五年存活率是7％，每年可導致將近600，000人死亡。雖然非洲和亞洲是肝癌的高發(fā)地，但是近些年在西方國家由于酒精性肝炎和HCV感染的增多，肝癌的發(fā)病率也在逐年上升。肝癌有幾種常見的流行病學特征：發(fā)病趨勢的動態(tài)性，基因突變區(qū)域的多樣性，種族和人群的差異，男性和女性發(fā)病率的差異，幾種常見的環(huán)境危險因子。 肝癌基因表達網絡的建立，作為

2、一項新的研究成果，已經為肝癌病人的診斷和預后提供了很好的平臺。如我們所期望的那樣，基于基因表達網絡建立的生物模型，能夠精確的區(qū)分肝癌組織和非肝癌組織。依據病因因子、腫瘤抑制基因的變異、復發(fā)率、肝功能代謝、腫瘤分期，不同的肝癌基因表達已經被確認。但是，大多數這些研究只是涉及了肝癌基因表達的某些側面，沒有反映觸發(fā)腫瘤形成的本質的生物學特性。這是因為mRNA水平不能精確地反映蛋白分子水平，也不能反映病因學分子轉錄水平上的蛋白質改變和蛋白質分子

3、降解水平上的改變。因此，分析腫瘤細胞和正常細胞間的蛋白質分子水平的改變，對于進一步完善肝癌基因表達網絡就顯得非常的重要。PathwayArray技術作為一項創(chuàng)新性的技術，能夠對蛋白質分子進行大規(guī)模的篩選。此項技術主要是應用于研究與腫瘤發(fā)展(發(fā)生、浸潤、轉移)相關的信號傳導通路。腫瘤細胞中高表達的蛋白分子與血管生成、細胞凋亡、細胞周期、DNA修復、轉移、細胞增殖、信號傳導、干細胞的分化都具有功能上的相關性。本課題主要是應用此項技術研究肝癌

4、組織和肝癌細胞當中的蛋白質分子表達水平。 肝癌作為慢性肝損傷的晚期階段，以肝小葉周邊多核肝癌細胞的浸潤性生長和毗鄰細胞凋亡抑制為主要特征。凋亡的抑制對于經受基因損傷和細胞形態(tài)學改變后的肝細胞的存活具有非常重要的作用，它們可以通過細胞的再生而保持高速的增殖。事實上，肝癌細胞對于各種誘導凋亡的刺激都保持著很強的耐受性。但是，目前對于肝癌細胞的抗凋亡機制的研究還不是很清楚。 最近的許多研究表明，凋亡抑制子(IAP)在凋亡的分子

5、調節(jié)機制中起著非常重要的作用。到目前為止，6種人類IAP蛋白，即XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、survivin和Apollon都已經得到證實。它們通常有1-3個由70個氨基酸組成的模體和一個BIR結構域；而其BIR結構域與桿狀病毒IAP蛋白序列具有高度的同源性，在與caspases結合及抑制caspases作用方面，特別是caspases3和caspases7，具有非常重要的作用。另外，c-IAP1和c-IAP2在酵母

6、雙雜交系統(tǒng)中可以與TRAF-1和TRAF-2相結合；這就表明c-IAP1和c-IAP2可以通過TRAF參與TNF誘導的NF-κB激活的調節(jié)。XIAP蛋白包含有3個BIR結構域和1個環(huán)形指狀結構域，與c-IAP1和c-IAP2相比，它具有更強的抑制caspase3和caspases7的作用[44-46]。XIAP的mRNA表達水平在除外周血淋巴組織外幾乎所有的人類組織當中都得到了檢測，這說明XIAP作為IAP家族的成員之一，是其中最具代表

7、性的一種。但是，關于XIAP在肝癌組織當中的蛋白表達水平和其在肝癌細胞調控方面的研究卻很少。 目的：將利用pathwayarray技術檢測XIAP在肝癌組織當中的表達水平，同時在體外進行肝癌細胞的XIAP小分子RNA干擾研究，觀察在特異性基因表達被敲低后，對肝癌腫瘤細胞增殖、周期、凋亡和其它蛋白質表達的影響情況；從而更深一步明確其在肝癌發(fā)生、發(fā)展、演進方面的作用。 方法：1、收集13個肝癌病人的組織標本，包括肝癌組織和肝

8、癌旁正常組織，進行pathwayarray實驗，研究其組織當中的蛋白質分子表達水平；2、根據pathwayarray結果，選取XIAP作為切入點，利用小分子RNA干擾技術，特異性敲低XIAP在hepG2/2.2.1(humanhepatocellularcarcinoma)細胞株中的基因表達水平，通過RT-PCR技術證實其表達情況；3、XIAPsiRNA成功轉染后，進行cellviabilityanalysis，研究XIAP在肝癌細胞增

9、殖方面的作用；4、XIAPsiRNA成功轉染后，進行cellcycleanalysis，研究XIAP在肝癌細胞周期方面的作用；5、XIAPsiRNA成功轉染后，進行cellapoptosisanalysis，研究XIAP在肝癌細胞凋亡方面的作用；6、XIAPsiRNA成功轉染后，進行pathwayarray實驗，研究XIAP基因表達敲低后，對肝癌細胞中其它蛋白質分子表達的影響情況。 結果：1、13對標本當中，每對標本我們都雜交了

10、44種磷酸化和非磷酸化蛋白，共檢測到23種蛋白，其中存在兩倍以上變化的蛋白有22種，其中XIAP、BRCA1、PCNA在肝癌組織中明顯的高表達；2、在XIAPsiRNA轉染進hepG2/2.2.1細胞株后，通過RT-PCR技術，檢測到肝癌細胞當中的XIAP基因表達水平被明顯敲低；3、XIAPsiRNA成功轉染后，與對照組相比較，實驗組中肝癌細胞數明顯減少(P<0.05)，故證明XIAP有促進肝癌細胞增殖的作用；4、XIAPsiRNA成功

11、轉染后，與對照組相比較，XIAPsiRNA實驗組出現(xiàn)了G1arrest，證明XIAP也參與肝癌細胞周期的調節(jié)；5、XIAPsiRNA成功轉染后，與對照組比較，XIAPsiRNA實驗組出現(xiàn)了較多壞死細胞，證明XIAP也參與肝癌細胞凋亡的調節(jié)；6、XIAPsiRNA成功轉染后，進行pathwayarray分析，我們雜交了66種磷酸化和非磷酸化蛋白，共檢測到26種蛋白，其中存在兩倍以上變化的蛋白有6種。XIAP可以下調ETS1的表達，同時可以