哺乳細胞暴露于化學致癌劑MNNG的候選生物標記物的篩選和鑒定.pdf

1、烷化劑尤其是N-亞硝基類烷化劑廣泛存在于環(huán)境中，引起DNA烷基化。其中單功能烷化劑N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是最常用于研究N-亞硝基類烷化劑的模式化學誘變劑和致癌劑，它能和DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子形成加合物(adduct)，這些加合物最終可導致染色體異常，點突變和細胞死亡。其引起的與突變有關(guān)的主要DNA損傷類型是06-甲基鳥嘌呤，這種損傷與腫瘤尤其是胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。 我們實驗室曾用一特殊的突變檢測系統(tǒng)，

2、直接證明DNA損傷劑可在哺乳動物細胞誘發(fā)非定標性突變：首先用低濃度(0.2μM)的短壽烷化劑MNNG(半壽期為1.1h)處理細胞2.5h后，繼續(xù)培養(yǎng)24h，將重組有用作突變檢測的靶基因supFtRNA基因的穿梭質(zhì)粒pZ189轉(zhuǎn)入細胞復制，發(fā)現(xiàn)在未受致癌物直接攻擊的穿梭質(zhì)粒中有較自發(fā)突變率高5倍以上的靶基因突變。這種突變并非在接受MNNG攻擊以后立刻出現(xiàn)，而是具有時相依存性，在致癌物攻擊后其發(fā)生率逐漸升高，在12h達最高峰，以后逐漸下降。

3、且突變譜明顯不同于由MNNG直接攻擊引起的定標性突變，有其突變好發(fā)部位的序列特異性。 進一步地，我們還證明了低濃度MNNG的作用下有廣泛的細胞反應(yīng)，尤其是在信號轉(zhuǎn)導通路的激活和基因表達的改變的研究中取得了一些突破性的進展。例如細胞表面受體如表皮生長因子受體、腫瘤壞死因子受體發(fā)生聚簇，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和細胞信號轉(zhuǎn)導通路cAMP-PKA-CREB和JNK/SAPK的激活。更值得注意的是這些有關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路的激活并不依賴于細胞核中的DN

4、A損傷，因為在除細胞核的細胞中這些信號通路的激活仍可被誘發(fā)。我們還利用mRNA差異顯示技術(shù)分離到了近30個在MNNG處理后表達改變的表達序列標簽(expressedsequencetag，EST)。其中9號片段在MNNG處理后表達增高，其表達改變不受蛋白質(zhì)合成抑制劑的影響。利用反義核酸技術(shù)構(gòu)建含反向插入9號片段的真核細胞表達重組體并轉(zhuǎn)染細胞，以獲得反義RNA阻斷vero細胞中相應(yīng)基因的表達，發(fā)現(xiàn)MNNG誘發(fā)的非定標性突變頻率顯著增高，提

5、示被阻斷的相關(guān)基因的表達產(chǎn)物可能參與抑制非定標性突變的發(fā)生。 生物標記物對于疾病的篩查、診斷、分期、預后、療效判斷以及監(jiān)測疾病復發(fā)是十分必要的。目前，高通量、自動化芯片技術(shù)的迅速發(fā)展，使生物標記物的鑒定在技術(shù)上有了重大的突破。但高通量基因組學技術(shù)只能在mRNA水平上反映基因表達的改變，并不能揭示所有與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)。已有很多資料表明細胞內(nèi)mRNA的表達水平同活性蛋白質(zhì)的量之間并不是簡單的線性關(guān)系，從mRNA的轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)的合成

6、并執(zhí)行功能受多個水平調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控及翻譯后調(diào)控。另外，基因組學技術(shù)也不能檢測蛋白質(zhì)之間是否發(fā)生相互作用、這些作用是怎樣發(fā)生的，及在不同的條件下蛋白質(zhì)的定位是否發(fā)生變化。因此從蛋白質(zhì)入手，通過一定的方法識別、分離和鑒定與疾病發(fā)生相關(guān)的差異表達蛋白質(zhì)，尋找疾病不同進展階段的關(guān)鍵蛋白，有助于更深入地闡明疾病發(fā)生的機理，并為尋找與早期診斷、治療和評估預后相關(guān)的標記物提供線索。 蛋白質(zhì)組學(Proteomics)是后基因組時代

7、生命科學研究的熱點領(lǐng)域。它是以蛋白質(zhì)組為研究對象，分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動規(guī)律。目前蛋白質(zhì)組學技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用到生物標記物的研究中。因此，我們實驗室用蛋白質(zhì)組學的方法研究低濃度烷化劑MNNG誘發(fā)的細胞應(yīng)答反應(yīng)。在這些差異表達的蛋白點中有36個蛋白點用基質(zhì)輔助激光解吸—飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)方法得到鑒定。這些鑒定的蛋白

8、可以作為評價MNNG暴露的候選標記物。然而，用于監(jiān)測人群暴露于致癌劑的最好的標本是體液，可以通過非創(chuàng)傷性手段獲取，經(jīng)濟方便。因此，最好的評價致癌劑暴露的生物標記物應(yīng)該是存在于體液中的從細胞中分泌或外漏的蛋白或從膜蛋白上脫落的肽段。體液如血液，尿液，胃液和唾液比組織更容易通過非創(chuàng)傷手段獲取，尋找體液中的候選生物標記物，可以方便的監(jiān)測人群是否暴露于有害環(huán)境。另外，因為血液等體液中成分復雜，而體液中的標記物往往是低豐度的，用一般蛋白質(zhì)組學方法

9、較難檢測。因此我們先確定細胞培養(yǎng)上清中的候選標記物，再進一步用免疫學方法檢測該標記物在血液等標本中的分布。 綜上所述，為尋找便于檢測的生物標記物并進一步闡明MNNG致突變的機制，我們收集了暴露于低濃度烷化劑MNNG的細胞培養(yǎng)上清(在一定程度上可以模擬體液)，蛋白經(jīng)超濾濃縮、冷丙酮沉淀和Bradford法定量后采用24cm，pH3-10的IPG膠條進行第一向等電聚焦，12.5％的SDS-PAGE進行第二向電泳分離，電泳后的凝膠用銀

10、染進行染色，并用Phoretix2D6.01軟件對電泳結(jié)果進行數(shù)據(jù)采集和圖像分析，建立烷化劑MNNG暴露組和對照組的細胞外蛋白質(zhì)差異表達圖譜。我們發(fā)現(xiàn)在MNNG處理后，與對照組相比，培養(yǎng)上清中出現(xiàn)的點有12個，表達上調(diào)的蛋白質(zhì)點有4個(P＜0.05)。 在此基礎(chǔ)上，我們切取差異表達的蛋白質(zhì)斑點，然后用特異性的胰酶消化蛋白質(zhì)，酶解后的肽段采用Voyager-DESTRMALDI-TOF(ABI)質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。利用質(zhì)譜分析得到

11、的原始數(shù)據(jù)，通過MSCOT搜索NCBInr的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，在16個差異表達的蛋白質(zhì)點中，13個蛋白點通過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫的檢索得到了初步的鑒定。這些鑒定的蛋白質(zhì)包括核型dUTP焦磷酸酶(DUT-N)、磷酸甘油酸變位酶(PGAM)、焦磷酸法呢酯合成酶(FPPS)、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)等。 另一方面，我們用雙向凝膠電泳方法分析低濃度MNNG處理后細胞裂解總蛋白的差異蛋白圖譜，其中471蛋白點

12、在MNNG處理后下調(diào)(P＜0.05)，質(zhì)譜鑒定該蛋白為核型dUTP焦磷酸酶。因此，核型dUTP焦磷酸酶特別引起了我們的注意。為進一步驗證雙向凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定結(jié)果的準確性，我們采用Westernblot方法證明了MNNG處理后DUT-N在細胞外液的出現(xiàn)以及它在細胞內(nèi)的表達下調(diào)。 通過對以上結(jié)果進行分析，我們得出如下結(jié)論：運用雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜分析的方法可以有效分離鑒定暴露于MNNG后細胞外液差異表達的蛋白質(zhì)，方法簡單，結(jié)果可信