反義寡核苷酸靶向hTERT對K562細(xì)胞株端粒酶活性和細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、本實驗設(shè)計靶向封閉hTERTmRNA的反義硫代寡核苷酸(antisensephosphorothioateoligodeoxynucleotide，ASPSODN)，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，觀察其對目的基因的抑制和對K562細(xì)胞端粒酶活性和細(xì)胞凋亡的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為hTERT作為反義基因治療靶點應(yīng)用于白血病治療提供一定的實驗依據(jù)。 研究方法：選用三種濃度的反義硫代寡核苷酸(ASPSODN)分別為0.2

2、μM、0.6μM、1.0μM，同時設(shè)空白組、脂質(zhì)體組和三種相同濃度正義硫代寡核苷酸(SPSODN)作為對照，分別轉(zhuǎn)染到人紅白血病細(xì)胞株K562，分別于24、48小時收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。用RT-PCR檢測靶基因hTERTmRNA的表達(dá)，PCR-ELISA檢測細(xì)胞端粒酶活性、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。觀察ASODN作用的特異性和不同濃度的ASODN對K562端粒酶活性和細(xì)胞凋亡的影響。 研究結(jié)果： 1、K562細(xì)胞被轉(zhuǎn)染24h后

3、，對K562細(xì)胞hTERT基因表達(dá)的影響(用hTERT與β-actine的比值表示，數(shù)據(jù)為掃描比值)脂質(zhì)體組(0.80±0.24)、0.2μM的ASODN(0.69±0.12)和SODNhTERT(0.72±0.25)mRNA的表達(dá)與空白對照組(0.85±0.28)無差異，0.6μM的ASODN(0.42±0.16)比脂質(zhì)體組能明顯下調(diào)hTERT表達(dá)，而同濃度的SODN(0.69±0.26)則下調(diào)不明顯，1.0μM的ASODN和SODN

4、對hTERT表達(dá)都表現(xiàn)出一定的抑制，采用苔盼藍(lán)拒染法染色顯示經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的1.0μM寡核苷酸無論正義、反義細(xì)胞死亡明顯增多。 2、24h端粒酶相對活性空白對照組為88.9﹪，脂質(zhì)體作用組為77.7﹪，兩者無顯著性差異，0.2μM、0.6μM、1.0μMASPSODN作用后端粒酶相對活性分別為60.6﹪、52﹪、58﹪，與空白對照組均有顯著性差異，其中0.6μM的ASPSODN與脂質(zhì)體作用組有顯著性差異(P=0.037)；而各正義

5、寡核苷酸組0.2μM、0.6μM、1.0μM端粒酶相對活性分別為76.1﹪、72.2﹪、65.7﹪，0.2μM、0.6μM正義寡核苷酸組與空白組、脂質(zhì)體作用組均無統(tǒng)計學(xué)意義。48hASPSODN各作用組則更進(jìn)一步抑制端粒酶活性，0.2μM、0.6μM、1.0μMASPSODN作用后端粒酶相對活性分別為61.0﹪、48.2﹪、53.0﹪；而48h各正義寡核苷酸組0.2μM、0.6μM、1.0μM端粒酶相對活性分別為74.8﹪、74.5﹪、

6、67.9﹪，0.2μM、0.6μMSPSODN作用組對端粒酶活性無明顯抑制。 3、流式細(xì)胞儀測0.6μM的ASPSODN和SPSODN組細(xì)胞凋亡率分別為4.34﹪和1.83﹪，脂質(zhì)體作用組為1.84﹪，空白對照組為1.07﹪，ASPSODN和SPSODN組兩者有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，ASPSODN組與脂質(zhì)體作用組及空白對照組有顯著性差異(P＜0.01)。 研究結(jié)論： 1、反義寡核苷酸靶向hTERT能特異性抑