MicroRNA-21負(fù)性調(diào)節(jié)Treg cells促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展.pdf

1、第一部分microRNA-21負(fù)性調(diào)節(jié)冠心病患者外周血Treg cells促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展
　　目的： Treg cells（regulatory T cells，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生于發(fā)展過(guò)程中起著重要的保護(hù)性作用。最近有研究表明microRNA-21高表達(dá)于冠心病患者血清中，并且根據(jù)以往的研究，Treg cells中也發(fā)現(xiàn)有 microRNA-21的表達(dá)。因此我們通過(guò)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)microRNA-21是否參

2、與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生于發(fā)展，以及其對(duì)Treg cells的作用。
　　方法：連續(xù)采集96名華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科住院患者病史資料及靜脈血，根據(jù)患者的臨床診斷將96名患者分成四個(gè)組分別為：AMI組（急性心肌梗死組）、UA組（不穩(wěn)定性心絞痛組）、SA組（穩(wěn)定性心絞痛組）和CPS組（胸痛綜合征組）。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中microRNA-21、Smad7、Foxp3、TGF-β1表達(dá)量，分離血清

3、ELISA檢測(cè)其中TGF-β1水平，以及流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè) Treg cells比例。并且，分離健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染分別使microRNA-21過(guò)表達(dá)和去表達(dá)，然后觀察上述指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：隨著冠心病患者疾病的進(jìn)展，外周血單個(gè)核細(xì)胞中Treg cells比例逐漸減低，microRNA-21的表達(dá)量逐漸升高，其下游靶基因Smad7的表達(dá)、Treg cells特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和誘導(dǎo)因子TGF-β1的表達(dá)均隨之

4、減低；同時(shí)上調(diào)microRNA-21的表達(dá)，Treg cells比例降低，Smad7、Foxp3和TGF-β1的表達(dá)也降低；相反地抑制microRNA-21的表達(dá)，Treg cells比例升高，Smad7、Foxp3和TGF-β1的表達(dá)也升高。
　　結(jié)論： microRNA-21隨著冠心病疾病的進(jìn)展表達(dá)增加，并且在這一過(guò)程中負(fù)性地調(diào)節(jié)Treg cells的比例和功能。
　　第二部分MicroRNA-21表達(dá)量隨著ApoE-/

5、-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展逐漸升高
　　目的：炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)重要的致病機(jī)制，Treg cells（regulatory T cells，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）能有效抑制T細(xì)胞炎癥反應(yīng)。microRNA-21被發(fā)現(xiàn)參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，但是它是如何參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生于發(fā)展的目前仍不明確。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，主動(dòng)脈中microRAN-21和其靶基因Smad7，以及Treg cells

6、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。
　　方法：高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，并用近交系C57BL/6J小鼠作為陰性對(duì)照組。分別于8周、16周、24周時(shí)摘眼球取血處死小鼠，所得的靜脈血離心獲取血漿ELISA檢測(cè)不同周齡兩組小鼠 TGF-β1水平。分離心臟，冰凍切片、油紅“0”染色，計(jì)算不同周齡小鼠主動(dòng)脈竇動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積。分離小鼠主動(dòng)脈，實(shí)時(shí)定量PCR及Western方法動(dòng)態(tài)觀察不同周齡兩組小鼠主動(dòng)脈中microRNA-21、Smad7、Fo

7、xp3和TGF-β1的表達(dá)水平，流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)脾臟單個(gè)核細(xì)胞中Treg cells的比例。
　　結(jié)果：給予高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化模型組從第8周，16周到24周均比同周齡的C57BL/6J陰性對(duì)照組油紅O染色的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積要大；并且ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化模型組第8周，16周到24周可以看到逐漸增加的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。隨著動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的增加，ApoE-/-組Treg cells比例逐漸降低并且明顯

8、低于同周齡的陰性對(duì)照組；同時(shí)主動(dòng)脈中microRNA-21的表達(dá)則是隨著動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展逐漸增加，而其靶基因 Smad7則明顯降低，Treg cells相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3和TGF-β1的表達(dá)也明顯降低。
　　第三部分 MicroRNA-21負(fù)性調(diào)節(jié)Treg cells不依賴(lài)TGF-β1/ Smad途徑
　　目的：在之前的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)microRNA-21隨著斑塊的進(jìn)展逐漸升高，并且在此過(guò)程中抑制其靶基因Sma

9、d7的表達(dá)，同時(shí)Treg cells及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子也逐漸降低。但是microRNA-21與其靶基因是否參與了動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展過(guò)程中Treg cells及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。因此本實(shí)驗(yàn)希望通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染明確小鼠單個(gè)核細(xì)胞中microRNA-21對(duì)Treg cells的比例和功能的影響，以及其具體的作用機(jī)制。
　　方法：分離小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染microRNA-21 mimic/microRNA-21

10、mimic control和microRNA-21 inhibitor/microRNA-21 inhibitor control，使小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞 microRNA-21過(guò)表達(dá)和去表達(dá)，收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞 PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后microRNA-21水平，同時(shí)PCR和western檢測(cè)Smad7、Foxp3和TGF-β1的表達(dá)水平，流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè) Treg cells比例；同樣適用小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞再分別轉(zhuǎn)染Smad7 plasmid/

11、Smad7 plasmid control和Anti-Smad7 siRNA/Anti-Smad7 siRNA control，使小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞 Smad7過(guò)表達(dá)和去表達(dá)，收集轉(zhuǎn)然后細(xì)胞 PCR和Western驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后Smad7水平和Foxp3表達(dá)變化，流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)Treg cells比例。
　　結(jié)果： microRNA-21過(guò)表達(dá)時(shí)，脾臟單個(gè)核細(xì)胞中Treg cells比例和Foxp3表達(dá)均降低，Smad7和TGF-

12、β1的表達(dá)也明顯降低；相反抑制microRNA-21的表達(dá)，細(xì)胞中的Treg cells比例和Foxp3表達(dá)則增加，單個(gè)核細(xì)胞中Smad7和TGF-β1的表達(dá)也增加。但是通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染無(wú)論是上調(diào)還是下調(diào)脾臟單核細(xì)胞中Smad7表達(dá)，Treg cells的比例和其特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論： microRNA-21可以負(fù)性調(diào)節(jié)脾臟單個(gè)核細(xì)胞中的Treg cells，并且microRNA-21對(duì)小鼠Treg c