骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)異種胰島移植免疫耐受的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病。WHO資料顯示:1994年世界糖尿病患者數(shù)量為1.2億人,1997年為1.35億,2000年為1.75億,預(yù)測2010年為2.39億,2030年則可達(dá)3億。目前雖然各種口服降糖藥物和胰島素的臨床應(yīng)用,使得糖尿病急性并發(fā)癥所導(dǎo)致的死亡率逐年下降,但尚難達(dá)到理想的糖尿病疾病控制目標(biāo),致使糖尿病患者最終發(fā)生慢性并發(fā)癥,導(dǎo)致傷殘甚至死亡。給社會和家庭帶來極

2、大的負(fù)擔(dān)。 因此,尋找一種能在糖尿病早期治療絕大多數(shù)病人的有效方法就顯得極為重要。胰腺、胰島移植給胰島素依賴型糖尿病患者帶來了新的希望,通過胰腺或胰島移植能有效的減少或脫離胰島素和降糖藥物的應(yīng)用,從而降低低血糖及遠(yuǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生。胰腺移植屬于有血管的器官移植,手術(shù)技術(shù)難度大,并發(fā)癥發(fā)病率高,還可能發(fā)生移植物抗宿主?。╣raft versus host disease,GVHD),限制了其臨床的應(yīng)用。而胰島細(xì)胞移植手術(shù)操作相對簡單

3、,不僅可以避免上述問題,而且還可以利用胰腺移植的邊緣供體。近年隨著胰島分離技術(shù)的改進(jìn)和新型免疫抑制藥物的研發(fā),胰島細(xì)胞移植在治療胰島素依賴型糖尿病方面取得了令人矚目的成果。 2000年,加拿大醫(yī)生James Shapiro領(lǐng)導(dǎo)的Edmondon研究小組采用全新的免疫治療方案及摒棄甾體激素,使得同種胰島移植取得了突破性的進(jìn)展。目前全球多中心研究結(jié)果顯示,應(yīng)用Edmondon治療方案移植后一年有約80%的患者脫離胰島素治療。雖然同種

4、胰島移植的巨大成功為徹底醫(yī)治胰島素依賴型糖尿病重新點燃了希望,但是人類供者器官和組織的嚴(yán)重短缺限制了這一治療方法的廣泛應(yīng)用。據(jù)美國的一項統(tǒng)計資料顯示,每年大約有5500例的尸體供者中,只有一小部分的胰腺可供器官移植。美國的胰島素依賴型糖尿病病人有100萬,而且每年另有3萬新增病例,因此,尋找新的胰島供源、有效延長移植物有功能存活時間是目前臨床胰島移植面臨的主要問題。合理使用免疫抑制藥物、誘導(dǎo)免疫耐受是解決移植排斥的可行方法。 骨

5、髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于骨髓的基質(zhì)細(xì)胞,具有強(qiáng)大的自我更新及組織修復(fù)能力。近年的研究發(fā)現(xiàn)MSCs可以參與調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞的生長和淋系細(xì)胞的發(fā)育,構(gòu)成早期淋巴細(xì)胞生長的微環(huán)境,在體外表現(xiàn)出抑制淋巴細(xì)胞增殖的活性。MSCs的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用已經(jīng)成為移植免疫耐受誘導(dǎo)和自身免疫性疾病治療研究的熱點。 本課題組前期的體外研究結(jié)果顯示了MSCs在免疫負(fù)調(diào)節(jié)和維持胰島功能方面的作用,本研究利用

6、大鼠到小鼠胰島移植動物模型,進(jìn)行了以下實驗研究:第一部分:采用全骨髓培養(yǎng)和貼壁純化的方法獲得近交系C57BL/6小鼠原代骨髓間充質(zhì)細(xì)胞,MSCs在體外擴(kuò)增后鑒定細(xì)胞的表型,用CM-DiI進(jìn)行熒光標(biāo)記,以利于體內(nèi)示蹤觀察MSCs的體內(nèi)分布。結(jié)果表明:本實驗體外擴(kuò)增C57BL/6小鼠MSCs方法簡單,細(xì)胞生長速度快,第1~2代的MSCs細(xì)胞,經(jīng)鑒定表型及純度可應(yīng)用于后期實驗研究。CM-DiI熒光標(biāo)記良好,標(biāo)記率高,方法簡單,可以用于MSCs

7、的體內(nèi)示蹤。第二部分:用0.5 mg/mlⅪ型膠原酶灌注消化和Euro-Ficoll不連續(xù)梯度離心分離的方法制備純化的SD大鼠胰島,DTZ染色計數(shù)胰島當(dāng)量,PI/FDA熒光標(biāo)記鑒定胰島細(xì)胞活力。結(jié)果表明:每只大鼠可得到胰島約960±146 IEQ,胰島細(xì)胞活力>90%,而其純度>90%。此分離純化大鼠胰島方法可以得到數(shù)量大、純度高、活性好的胰島細(xì)胞。第三部分:CM-DiI熒光標(biāo)記的C57BL/6小鼠MSCs與300 IEQ的SD大鼠胰島

8、聯(lián)合移植入BALB/c小鼠腎包膜下,并在移植后的第0、3、5天靜脈輸注CM-DiI標(biāo)記的MSCs,移植后9天處死動物。結(jié)果顯示:MSCs聯(lián)合胰島移植組移植后7天時平均血糖(12.64±4.1)mmol/l較單純胰島移植組(19.52±3.4)mmol/l低;熒光免疫組化證實聯(lián)合移植組仍有功能性胰島殘存;冰凍切片顯示同基因CM-DiI-MSCs主要分布在受者免疫器官,胸腺最多,其次脾臟,再次是淋巴結(jié),肝臟未發(fā)現(xiàn);受者脾臟T細(xì)胞亞群流式細(xì)胞

9、儀檢測結(jié)果顯示:CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例較單純胰島移植組低(P<0.05),CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值較PBS對照組略有升高,但低于單純胰島移植組,CD4+CD25+雙陽性細(xì)胞量與對照組無顯著差異。盡管有結(jié)果顯示MSCs在靈長類皮膚移植和臨床腎臟移植中均在不同程度上有誘導(dǎo)移植耐受的作用,但本研究在大鼠到小鼠移植模型中未能觀察到明顯的耐受誘導(dǎo)效果,其原因可能有:①MSCs的治療用量問題;②聯(lián)合應(yīng)用少量免疫抑制劑,MSCs可能作為

10、一種輔助誘導(dǎo)耐受方法,單純應(yīng)用MSCs誘導(dǎo)耐受效果不明顯;③實驗動物數(shù)量偏少,數(shù)據(jù)結(jié)果分析雖然有統(tǒng)計學(xué)意義,但實際差異不大;④本身嚙齒類動物與非人靈長類和人類免疫系統(tǒng)的差異。 綜上,本研究主要關(guān)注了MSCs誘導(dǎo)移植免疫耐受方面的生物學(xué)功能,以嚙齒動物為模型研究了MSCs在體內(nèi)對移植胰島的功能和受者免疫系統(tǒng)的影響,證實了MSCs對移植胰島的保護(hù)作用及MSCs主要分布在受者免疫系統(tǒng),為后期研究MSCs對免疫系統(tǒng)的作用及為將來豬到人異

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