突變?nèi)薈D59基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)活性研究.pdf

1、目的 構(gòu)建突變?nèi)薈D59的真核表達(dá)系統(tǒng),獲得高效表達(dá)突變?nèi)薈D59的CHO細(xì)胞株,并進(jìn)行糖化和非糖化突變?nèi)薈D59蛋白功能的檢測,探討CD59作為補(bǔ)體攻膜復(fù)合體抑制物在糖尿病血管并發(fā)癥病理機(jī)制中的重要作用,為人類糖尿病血管增殖癥的發(fā)病機(jī)理提供依據(jù).方法突變?nèi)薈D59的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的建立:將含有突變?nèi)薈D59的重組PALTER-MAX質(zhì)粒與PcDNA運(yùn)用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法共轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞;用新霉素類似物(G418)篩選出陽性克隆,并

2、用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步篩選出高效表達(dá)克隆,建立穩(wěn)定高效表達(dá)CHO細(xì)胞株.應(yīng)用免疫組化方法、免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步鑒定穩(wěn)定高效表達(dá)CHO細(xì)胞株;裂解細(xì)胞,應(yīng)用SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、固相酶聯(lián)免疫吸附試驗驗證穩(wěn)定高效表達(dá)陽性細(xì)胞CD59的表達(dá);高糖培養(yǎng)穩(wěn)定高效表達(dá)陽性細(xì)胞,并運(yùn)用BCECF染料釋放試驗研究糖化和非糖化突變?nèi)薈D59的抗補(bǔ)體活性.結(jié)論1.構(gòu)建突變?nèi)薈D59 HM1、HM2的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),獲得穩(wěn)定高效表達(dá)突變?nèi)薈