真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-MDC-IFN-γ的構(gòu)建及其免疫佐劑效果研究.pdf

1、目的：柯薩奇病毒B組(Coxsackievirus group B，CVB)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是非常嚴(yán)重的人類(lèi)疾病的致病病原，它的感染可以造成嚴(yán)重的心肌炎、心包炎，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，50％左右的心肌炎與近期或復(fù)發(fā)的柯薩奇病毒B組3型(CVB3)感染有關(guān)。近年來(lái)，DNA疫苗的研究發(fā)展在CVB3感染的防治方面起到了至關(guān)重要的作用。VP1是CVB3的主要衣殼蛋白，具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體。我實(shí)驗(yàn)室曾利用

2、DNA疫苗的靶向策略，構(gòu)建融合DNA疫苗pcDNA3/MDC-VP1，免疫小鼠后顯著提高了中和抗體滴度，對(duì)致死量病毒攻擊的保護(hù)作用有一定的提高，但仍達(dá)不到滿(mǎn)意的效果。因此，尋找合適的基因佐劑，提高CVB3DNA疫苗的免疫效果成為目前的研究焦點(diǎn)。
　　 巨噬細(xì)胞源趨化因子(macrophage-derived chemokine，MDC)屬于CC趨化因子家族，具有趨化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞等功能，其帶有信號(hào)肽序列，

3、可分泌到細(xì)胞外與Th2細(xì)胞、APCs等細(xì)胞膜上表達(dá)的受體（CCR4等）結(jié)合發(fā)揮趨化作用。MDC主要增強(qiáng)Th2細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)，是因?yàn)镸DC對(duì)Th2細(xì)胞(Th2細(xì)胞選擇性高表達(dá)CCR4)具有強(qiáng)烈的趨化作用。
　　 IFN-Υ是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可增強(qiáng)NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞對(duì)病毒的殺傷和吞噬作用，抑制病毒的復(fù)制。IFN-Υ促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1型分化，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫。增加抗原遞呈細(xì)胞的MHc-Ⅱ分子表達(dá)，能夠產(chǎn)生CTL應(yīng)

4、答和提高IgG抗體。
　　 本研究選用IFN-Υ基因，與MDC構(gòu)建融合基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-γ，作為基因佐劑，和pcDNA3/MDC-VP1共免疫，檢測(cè)免疫效果，探討其用作基因佐劑，有無(wú)提高CVB3 VP1 DNA疫苗的免疫效應(yīng)。以尋找最有效輔佐DNA疫苗的基因佐劑。
　　 方法：
　　 1.重組質(zhì)粒pMD18-T/IFN-Υ的構(gòu)建根據(jù)IFN-Υ基因序列及MDC序列，設(shè)計(jì)帶有BamHI和Xho

5、I酶切位點(diǎn)的特異性引物，用PCR方法從質(zhì)粒pcDNA3/IFN-中擴(kuò)增IFN-Υ基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T vector連接，轉(zhuǎn)化入E.coli5a感受態(tài)菌，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T/IFN-Υ。
　　 2.真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-Υ的構(gòu)建取經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切的Linker-IFN-Υ與經(jīng)過(guò)同樣兩種酶切的pcDNA3/MDC-Linker片段連接，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒

6、定后，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-γ。
　　 3.用堿裂解法從轉(zhuǎn)化的E.coli5a中大量提取質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-γ，用聚乙二醇(PEG)沉淀法進(jìn)行純化。
　　 4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組20只。5組分別為生理鹽水對(duì)照組、pcDNA3/ IFN-Υ對(duì)照組、pcDNA3/VP1對(duì)照組、pcDNA3/MDC-VP1對(duì)照組，pcDNA3/MDC-IFN-

7、Υ＋pcDNA3/MDC-VP1組。純化后的質(zhì)粒以生理鹽水稀釋后，股四頭肌注射免疫小鼠，每次每只接種100μg，每3周接種1次，共免疫3次；每次免疫接種后第14天，內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，用微量中和試驗(yàn)（固定病毒-稀釋血清法）檢測(cè)血清中CVB3特異性中和抗體。
　　 5.末次免疫后3周，用5LD50的CVB3腹腔內(nèi)攻擊，觀察并記錄小鼠死亡情況至感染后第21天。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pMD1

8、8-T/IFN-Υ，限制酶切分析證明符合預(yù)期設(shè)計(jì)。
　　 2.成功構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-Υ，酶切鑒定可見(jiàn)特異性條帶。
　　 3.大量抽提質(zhì)粒 pcDNA3/IFN-Υ、 pcDNA3/MDC-IFN-Υ、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1，純化后再次酶切鑒定，除可見(jiàn)預(yù)期的特異性條帶外，未見(jiàn)其他非特異性條帶。
　　 4.接種小鼠后，各組血清中和抗體的平均效價(jià)分別為：pcD

9、NA3/MDC-VP1組1:7.32,1:16.82,1：27.32；pcDNA3/MDC-IFN-Υ＋pcDNA3/MDC-VP1組1:7.58,1:18.66,1:30.31；生理鹽水對(duì)照組、pcDNA3/IFN-Υ組、pcDNA3/VP1組各次平均效價(jià)均低于1:5。可見(jiàn)第二次免疫后pcDNA3/MDC-VP1組和pcDNA3/MDC-IFN-＋pcDNA3/MDC-VP1組小鼠的中和抗體效價(jià)開(kāi)始顯著升高；對(duì)這兩組第一、二、三次免疫

10、后中和抗體效價(jià)單因素方差分析后發(fā)現(xiàn)，兩組第二、三次免疫接種后的抗體效價(jià)和第一次相比均有顯著性差異，表明抗體的效價(jià)隨注射次數(shù)的增加而提高。但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.用5LD50攻擊小鼠，各組21天生存率分別為：①組（生理鹽水對(duì)照組）10％，②組（pcDNA3/IFN-組）20％,③組(pcDNA3/VP1組)15％,④組（pcDNA3/MDC-VP1組）40％,⑤組（pcDNA3/MDC-IFN-Υ＋pcDNA3/

11、MDC-VP1組）35％。經(jīng)過(guò)x2檢驗(yàn)分析，尚不能確定后兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T/IFN-Υ。
　　 2.成功構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-Υ。
　　 3.小鼠免疫后血中中和抗體滴度隨免疫次數(shù)的增加而提高，在pcDNA3/MDC-IFN-Υ＋pcDNA3/MDC-VP1聯(lián)合免疫組和pcDNA3/MDC-VP1單獨(dú)免疫組中比較，免疫無(wú)