真核表達質(zhì)粒pcDNA3-MDC-IFN-γ的構(gòu)建及其免疫佐劑效果研究.pdf

1、目的：柯薩奇病毒B組(Coxsackievirus group B，CVB)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是非常嚴重的人類疾病的致病病原，它的感染可以造成嚴重的心肌炎、心包炎，根據(jù)流行病學調(diào)查顯示，50％左右的心肌炎與近期或復發(fā)的柯薩奇病毒B組3型(CVB3)感染有關(guān)。近年來，DNA疫苗的研究發(fā)展在CVB3感染的防治方面起到了至關(guān)重要的作用。VP1是CVB3的主要衣殼蛋白，具有較強的免疫原性，可誘導機體產(chǎn)生保護性中和抗體。我實驗室曾利用

2、DNA疫苗的靶向策略，構(gòu)建融合DNA疫苗pcDNA3/MDC-VP1，免疫小鼠后顯著提高了中和抗體滴度，對致死量病毒攻擊的保護作用有一定的提高，但仍達不到滿意的效果。因此，尋找合適的基因佐劑，提高CVB3DNA疫苗的免疫效果成為目前的研究焦點。
　　 巨噬細胞源趨化因子(macrophage-derived chemokine，MDC)屬于CC趨化因子家族，具有趨化單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞等功能，其帶有信號肽序列，

3、可分泌到細胞外與Th2細胞、APCs等細胞膜上表達的受體（CCR4等）結(jié)合發(fā)揮趨化作用。MDC主要增強Th2細胞相關(guān)的免疫反應，是因為MDC對Th2細胞(Th2細胞選擇性高表達CCR4)具有強烈的趨化作用。
　　 IFN-Υ是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可增強NK細胞、單核巨噬細胞對病毒的殺傷和吞噬作用，抑制病毒的復制。IFN-Υ促進Th0細胞向Th1型分化，增強機體的細胞免疫。增加抗原遞呈細胞的MHc-Ⅱ分子表達，能夠產(chǎn)生CTL應

4、答和提高IgG抗體。
　　 本研究選用IFN-Υ基因，與MDC構(gòu)建融合基因表達質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-γ，作為基因佐劑，和pcDNA3/MDC-VP1共免疫，檢測免疫效果，探討其用作基因佐劑，有無提高CVB3 VP1 DNA疫苗的免疫效應。以尋找最有效輔佐DNA疫苗的基因佐劑。
　　 方法：
　　 1.重組質(zhì)粒pMD18-T/IFN-Υ的構(gòu)建根據(jù)IFN-Υ基因序列及MDC序列，設(shè)計帶有BamHI和Xho

5、I酶切位點的特異性引物，用PCR方法從質(zhì)粒pcDNA3/IFN-中擴增IFN-Υ基因，將擴增產(chǎn)物與pMD18-T vector連接，轉(zhuǎn)化入E.coli5a感受態(tài)菌，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T/IFN-Υ。
　　 2.真核表達質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-Υ的構(gòu)建取經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切的Linker-IFN-Υ與經(jīng)過同樣兩種酶切的pcDNA3/MDC-Linker片段連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒

6、定后，構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-γ。
　　 3.用堿裂解法從轉(zhuǎn)化的E.coli5a中大量提取質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-γ，用聚乙二醇(PEG)沉淀法進行純化。
　　 4.動物實驗：將6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機分為5組，每組20只。5組分別為生理鹽水對照組、pcDNA3/ IFN-Υ對照組、pcDNA3/VP1對照組、pcDNA3/MDC-VP1對照組，pcDNA3/MDC-IFN-

7、Υ＋pcDNA3/MDC-VP1組。純化后的質(zhì)粒以生理鹽水稀釋后，股四頭肌注射免疫小鼠，每次每只接種100μg，每3周接種1次，共免疫3次；每次免疫接種后第14天，內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，用微量中和試驗（固定病毒-稀釋血清法）檢測血清中CVB3特異性中和抗體。
　　 5.末次免疫后3周，用5LD50的CVB3腹腔內(nèi)攻擊，觀察并記錄小鼠死亡情況至感染后第21天。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pMD1

8、8-T/IFN-Υ，限制酶切分析證明符合預期設(shè)計。
　　 2.成功構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-Υ，酶切鑒定可見特異性條帶。
　　 3.大量抽提質(zhì)粒 pcDNA3/IFN-Υ、 pcDNA3/MDC-IFN-Υ、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1，純化后再次酶切鑒定，除可見預期的特異性條帶外，未見其他非特異性條帶。
　　 4.接種小鼠后，各組血清中和抗體的平均效價分別為：pcD

9、NA3/MDC-VP1組1:7.32,1:16.82,1：27.32；pcDNA3/MDC-IFN-Υ＋pcDNA3/MDC-VP1組1:7.58,1:18.66,1:30.31；生理鹽水對照組、pcDNA3/IFN-Υ組、pcDNA3/VP1組各次平均效價均低于1:5?？梢姷诙蚊庖吆髉cDNA3/MDC-VP1組和pcDNA3/MDC-IFN-＋pcDNA3/MDC-VP1組小鼠的中和抗體效價開始顯著升高；對這兩組第一、二、三次免疫

10、后中和抗體效價單因素方差分析后發(fā)現(xiàn)，兩組第二、三次免疫接種后的抗體效價和第一次相比均有顯著性差異，表明抗體的效價隨注射次數(shù)的增加而提高。但兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　 5.用5LD50攻擊小鼠，各組21天生存率分別為：①組（生理鹽水對照組）10％，②組（pcDNA3/IFN-組）20％,③組(pcDNA3/VP1組)15％,④組（pcDNA3/MDC-VP1組）40％,⑤組（pcDNA3/MDC-IFN-Υ＋pcDNA3/

11、MDC-VP1組）35％。經(jīng)過x2檢驗分析，尚不能確定后兩組之間有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T/IFN-Υ。
　　 2.成功構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-Υ。
　　 3.小鼠免疫后血中中和抗體滴度隨免疫次數(shù)的增加而提高，在pcDNA3/MDC-IFN-Υ＋pcDNA3/MDC-VP1聯(lián)合免疫組和pcDNA3/MDC-VP1單獨免疫組中比較，免疫無