非質(zhì)粒依賴型菌蛻疫苗及其中藥免疫佐劑的研究.pdf

1、菌蛻(Bacterial ghosts，BGs)是通過克隆的PhiXl74噬菌體溶菌基因E的可調(diào)控表達而形成的、缺少細胞漿和核酸的、無繁殖能力的革蘭氏陰性細菌菌體?？寺≡谫|(zhì)粒上的PhiX 174噬菌體的E基因在大腸桿菌中表達后通過寡聚化可形成一跨膜孔道，導(dǎo)致宿主菌細胞內(nèi)容物外流而溶菌形成菌蛻。這種由E基因介導(dǎo)制備的菌蛻實際上是在非變性條件下滅活了的細菌菌體，與至今仍在使用的傳統(tǒng)的變性滅活菌苗相比，菌蛻完好地保留了細菌菌體的各種抗原結(jié)構(gòu)，

2、沒有任何免疫原性的改變，因此是一種優(yōu)良的候選滅活菌體疫苗。本課題在常規(guī)的質(zhì)粒依賴型菌蛻的研究基礎(chǔ)上，研究構(gòu)建了非質(zhì)粒依賴型菌蛻菌株。與質(zhì)粒依賴型相比，這種非質(zhì)粒依賴型菌蛻菌株可避免由于溶菌質(zhì)粒的丟失而導(dǎo)致的溶菌效率降低，同時不需要抗生素進行篩選．為菌蛻疫苗的制備縮減了成本，且可避免造成抗生素的耐用，因此具有更大的應(yīng)用潛力。 中藥具有不良反應(yīng)少、毒副作用小和無依賴性等特點，且對機體的免疫系統(tǒng)具有多方面的重要調(diào)節(jié)作用。本課題以此為著

3、眼點，將中藥復(fù)方玉屏風(fēng)散制備成玉屏風(fēng)注射液，作為菌蛻疫苗的免疫佐劑，進行實驗動物(雞)的免疫試驗，對免疫效果進行評定。主要研究內(nèi)容包括： 1. 質(zhì)粒pTLacZ：LC的構(gòu)建以禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC)野毒株RC-123為研究材料，PCR擴增出其基因組DNA中的LacZ基因，通過TA克隆構(gòu)建質(zhì)粒pTLacZ。從廣宿主溶菌質(zhì)粒pBBRlys上擴增E基因溶菌表達盒(

4、lysis cassette，LC)，TA克隆構(gòu)建質(zhì)粒p-T-LC。p-T-LC與pTLacZ經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶BssHII酶切后，可得到LC片段和從LacZ基因內(nèi)切開的線性化pTLacZ，再經(jīng)連接酶將二者連接，即可構(gòu)建成LC位于LacZ基因中的質(zhì)粒pTLacZ：LC。 2.非質(zhì)粒依賴型菌蛻菌株的構(gòu)建從質(zhì)粒pTLacZ：lC中PCR擴增出LacZ：IC等位基因片段，電擊轉(zhuǎn)化入RC-123電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞中。等位基因片段LacZ：L

5、C與RC-123基因組DNA以LacZ基因兩端為同源臂，發(fā)生雙交換同源重組突變，溶菌表達盒LC插入RC-123基因組的LacZ基因中并使LacZ基因失活，在篩選培養(yǎng)基上呈白色菌落，即為RC-123的非質(zhì)粒依賴型菌蛻疫苗菌株RC-123(LC)。 3.溶菌動力學(xué)試驗將RC-123(LC)于28℃培養(yǎng)至OD600nm約為0.4，迅速提高培養(yǎng)溫度至42℃進行溫度誘導(dǎo)溶菌。誘導(dǎo)開始后60～75min之間開始出現(xiàn)溶菌，約兩小時誘導(dǎo)基本完成

6、。溶菌前后的培養(yǎng)物CFU從1.02x108(cfu/ml)下降到8.16×102，溶菌滅活效率達劍99.9992％，略高于質(zhì)粒依賴型菌蛻菌株RC．123(pBBRIys)。 4.玉屏風(fēng)注射液的制備按中藥復(fù)方玉屏風(fēng)散的比例稱取黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三味中藥材，采用水醇法制備成玉屏風(fēng)注射液(1g/ml)。玉屏風(fēng)注射液為棕紅色至棕褐色澄清液體，PH值為4.0～5.5，符合藥典要求。給7日齡健康雛雞肌肉注射玉屏風(fēng)注射液0.8mL/只(相當(dāng)于4倍注射用

7、量)，雛雞的精神、采食、排便情況均無異常，證明玉屏風(fēng)注射液具有安全性。 5.免疫保護試驗將RC-123(LC)菌蛻疫苗和傳統(tǒng)的RC-123甲醛滅活苗分別免疫健康雛雞，比較免疫保護效果。同時，將玉屏風(fēng)注射液作為菌蛻疫苗佐劑，設(shè)置了兩組玉屏風(fēng)佐劑的應(yīng)用方案，即佐劑I組于接種前一天及接種時各注射1次、佐劑II組僅接種當(dāng)日與菌蛻疫苗同時肌肉注射1次，對各組的免疫效力進行比較。結(jié)果表明，RC-123(LC)菌蛻疫苗組雞只(C組)對同源株攻