HVJ-E免疫佐劑的特性研究.pdf

1、新城疫和禽流感是全球禽類重要的傳染性疾病,如不采取嚴(yán)格、有效的控制措施,可迅速引起動(dòng)物發(fā)病和死亡,給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前這兩種疾病可通過(guò)疫苗接種來(lái)預(yù)防和控制。但常用的滅活苗佐劑(如油乳和鋁鹽)通常會(huì)引起較強(qiáng)的局部反應(yīng),包括疼痛、炎癥等,或不能增強(qiáng)抗原的免疫原性。因此,需要研究和開發(fā)新型、高效、低毒的免疫佐劑。
　　 日本血凝病毒(Hemagglutinating virus of Japan,HVJ)亦稱仙臺(tái)病毒,是一種

2、具有血凝性和高效膜融合功能的包膜病毒,經(jīng)紫外線滅活失去感染性的病毒囊膜(Hemagglutinating virus of Japan Envelope,HVJ-E)具有雙重的免疫調(diào)節(jié)作用,可以同時(shí)促進(jìn)先天性免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)。許多研究證明,HVJ-E可刺激樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)成熟,并刺激DC產(chǎn)生IFNs和IL-6等細(xì)胞因子,其中IL-6能抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化,促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞和NK細(xì)胞的產(chǎn)生,阻止I

3、L-10、TGF等免疫抑制性細(xì)胞因子的分泌,具有明顯的免疫增強(qiáng)作用。但HVJ-E直接作為免疫佐劑的研究尚未見報(bào)道,因此,本研究通過(guò)將HVJ-E分別與新城疫或禽流感H9N2滅活苗共同免疫,從抗體產(chǎn)生水平,細(xì)胞因子激發(fā)水平和經(jīng)病毒攻擊后的保護(hù)水平三個(gè)方面來(lái)研究HVJ-E的免疫佐劑特性。研究主要從以下三個(gè)方面進(jìn)行探討:
　　 (1)HVJ-E誘導(dǎo)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞成熟的研究:體外分離培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(murine

4、marrow-derived dendritic cell,mDC),清洗細(xì)胞懸液,離心取細(xì)胞沉淀(2×106)鋪6孔板,并加50 ng/mL鼠重組GM-CSF和IL-4,5 d后棄去懸浮細(xì)胞,收集半貼壁的未成熟的樹突狀細(xì)胞。DC經(jīng)HVJ-E刺激48 h后,ELISA檢測(cè)各組DC上清中細(xì)胞因子的分泌水平,流式細(xì)胞儀測(cè)定DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)率。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,相對(duì)于PBS刺激組,經(jīng)HVJ-E刺激后DC所分泌的IFN-β、IL-6

5、、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)水平顯著升高;流式細(xì)胞儀分析顯示HVJ-E刺激的DC引起細(xì)胞表面的共刺激分子CD40、CD80、MHC II和CD11c也呈現(xiàn)較高水平表達(dá);研究結(jié)果充分說(shuō)明了HVJ-E可以刺激小鼠樹突狀細(xì)胞的成熟化和細(xì)胞因子的分泌。
　　 (2)HVJ-E作為新城疫滅活苗免疫佐劑的研究:將SPF雞隨機(jī)分為四組,每組20只,分別為滅活苗(KV)組、HVJ-E(1.5×109)+KV組、HVJ-E(1.5×109)組和

6、PBS組。分別于免疫后7 d、14 d、21 d翅靜脈采血,分離血清并測(cè)定抗體水平;免疫后21 d以ND強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒,攻毒后2 d、4 d、7 d、10 d采集口咽腔、泄殖腔棉拭子,接種SPF雞胚,分離病毒;統(tǒng)計(jì)分析HVJ-E對(duì)ND滅活苗的免疫促進(jìn)作用。結(jié)果顯示,HVJ-E+KV組的抗體水平較滅活苗(KV)組顯著提高(p＜0.05);攻毒結(jié)果顯示,HVJ-E+KV組能使被免疫雞完全保護(hù)且沒(méi)有排毒。研究結(jié)果提示,HVJ-E可以作為NDV滅

7、活苗的免疫佐劑。
　　 (3)HVJ-E作為禽流感H9亞型滅活苗免疫佐劑的研究:將SPF雞隨機(jī)分為四組免疫,分組及免疫方式同前。免疫后7 d、14 d、21 d采血,分離血清,測(cè)定抗體水平和細(xì)胞因子水平;免疫后14 d、21 d,分離淋巴細(xì)胞,提取RNA,半定量RT-PCR檢測(cè)IFN-γ和IFN-β的表達(dá)水平;免疫后21 d鼻內(nèi)攻毒,攻毒后2 d、4 d、7 d、10 d采集口咽腔、泄殖腔棉拭子,接種SPF雞胚,分離病毒;統(tǒng)計(jì)分

8、析HVJ-E對(duì)H9滅活苗的免疫促進(jìn)作用。結(jié)果顯示,免疫后7 d,HVJ-E+KV組和KV組可檢測(cè)到特異性抗體,但兩組間沒(méi)有明顯差異;免疫后14 d和21 d,HVJ-E+KV組比KV組的抗體水平要高,且差異顯著(p＜0.05);HVJ-E組和HVJ-E+KV組細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平比PBS組和KV組的高;攻毒結(jié)果顯示,PBS組的陽(yáng)性分離率要比其他組高(p＜0.05),且各組都沒(méi)有死亡,HVJ-E+KV組比KV組的病毒分離率降低(p＜