豬帶絳蟲HSP70-4真核表達(dá)及其免疫佐劑效應(yīng)研究.pdf

1、豬囊尾蚴病是豬帶絳蟲的幼蟲—囊尾蚴所引起的一種重要的人畜共患寄生蟲病，被世界衛(wèi)生組織列為17種最易被忽略的熱帶病之一。該病呈世界性分布，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，同時還威脅著人類的身體健康。雖然廣譜抗蠕蟲藥吡喹酮、丙硫咪唑?qū)ωi囊尾蚴病有一定的治療效果，但其副作用嚴(yán)重，長期使用還會產(chǎn)生耐藥性。因此，疫苗的研究顯得尤為重要。豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18重組蛋白作為主要的候選抗原之一，具有較好的免疫保護(hù)力，但穩(wěn)定性較差，分子量?。▋H為16k

2、u），對其免疫效果造成了一定影響。
　　熱休克蛋白70（HSP70）是一類在結(jié)構(gòu)和功能上高度保守的蛋白，具有分子伴侶、抗原遞呈、抗感染免疫、抑制細(xì)胞凋亡等作用，現(xiàn)已被廣泛用作佐劑或抗原載體來增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)力。為了提高豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18重組蛋白的穩(wěn)定性以及免疫保護(hù)力，我們開展了將豬帶絳蟲 HSP70-4（TsHSP70-4）作為免疫佐劑的研究，目的是為豬帶絳蟲基因工程疫苗免疫佐劑的選擇提供新的思路。研究取得了如下結(jié)果：<

3、br>　　1．參考GeneDB中豬帶絳蟲基因組注釋信息，設(shè)計(jì)特異性引物，RT-PCR獲得TsHSP70-4 ORF序列，全長為1953bp。根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，對 TsHSP70-4基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，連接載體pPIC9K，在畢赤酵母中進(jìn)行高效表達(dá)，獲得大小約為95kD的重組蛋白。Western-blot檢測及質(zhì)譜分析表明，獲得的重組蛋白即為TsHSP70-4。
　　2．將TsHSP70-4用柔性linker與豬帶絳蟲六鉤蚴

4、TSOL18的N端相連，在畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了大小約為115kD的融合蛋白TsHSP70-4-TSOL18。
　　3．以TsHSP70-4作為佐劑，與TSOL18混合免疫（即TsHSP70-4+TSOL18免疫組）可以延長其在小鼠體內(nèi)的作用時間；在免疫的第18天，該免疫組小鼠血清中 IL-4、IFN-γ的濃度與TSOL18免疫組相比較，存在顯著提高；在第21天，該免疫組小鼠血清中IL-10的濃度與TSOL18免疫組比較，有明

5、顯增強(qiáng)；在第21天和第28天，對全血T淋巴細(xì)胞亞群測定分析，該免疫組 CD3+CD4+的百分率均有顯著提高。由此可知，TsHSP70-4與TSOL18混合免疫，可以延長TSOL18在體內(nèi)的滯留時間，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，特別是體液免疫水平。
　　4．用 TsHSP70-4-TSOL18融合蛋白免疫小鼠，獲得的免疫效果遠(yuǎn)低于 TsHSP70-4+TSOL18免疫組和TSOL18免疫組。
　　綜合上述，TsHSP70-4可以作