皮蠅素基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫特性的研究.pdf

1、牛皮蠅蛆病主要是牛皮蠅和紋皮蠅的幼蟲寄生在牛體內(nèi)引起的一種寄生蟲病。該病危害很嚴(yán)重，對養(yǎng)牛業(yè)和皮革加工業(yè)有著非常大的影響，而且妨礙公共衛(wèi)生引發(fā)人畜共患病，現(xiàn)行的藥物防治方法存在副作用，畜產(chǎn)品藥物殘留等缺點。因此人們越來越重視該病的免疫防治研究。
　　本研究以重組克隆載體pTHA和pTHC為模板，利用PCR技術(shù)和重疊延伸剪接技術(shù)，擴(kuò)增HA-HC融合基因，連接到克隆載體pMD19-T simple vector中，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pM

2、D19-T-HAC（簡稱pTHAC）。將HA、HC、HA-HC基因亞克隆到真核表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-HA(簡稱pVHA)、pVAX1-HC（簡稱pVHC）和pVAX1-HAC(簡稱pVHAC)。將各重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞和牛胎兒成纖維細(xì)胞，檢測目的基因的瞬時表達(dá)情況。在體內(nèi)將各重組表達(dá)質(zhì)粒和空載體pVAX1及PBS免疫昆明小鼠，共免疫3次，每次間隔2周，采8次血清，應(yīng)用間接ELISA方法檢測血

3、清抗體效價。第3次免疫2周后，以紋皮蠅重組蛋白為刺激原，MTT法檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖情況；再以γ干擾素酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ含量。結(jié)果表明：與空載體pVAX1和PBS對照組相比，各重組表達(dá)質(zhì)粒免疫組小鼠的抗體水平逐漸上升，差異極顯著（P﹤0.01）。第3次免疫2周后，DNA疫苗免疫組的淋巴細(xì)胞增殖試驗刺激值（SI）高于對照組，差異極顯著（P﹤0.01）；雙價 DNA疫苗組的刺激值高于單價 DNA疫苗