小鼠pEGFP-NeuroD重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在肝癌細胞中的表達后功能的初步探討.pdf

1、實驗?zāi)康模?神經(jīng)分化因子1（NeuroD-1）又名B細胞E盒轉(zhuǎn)錄激活因子2（BETA-2），屬于組織特異性的B類bHLH蛋白，作為轉(zhuǎn)錄因子，NeuroD-1基因是β細胞特異和有效表達胰島素基因所必需。在基因敲除小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)[1]，BETA-2基因缺失的小鼠因為β細胞數(shù)量的大量減少和缺少適量的胰島形成，出現(xiàn)嚴(yán)重的糖尿病并在圍產(chǎn)期死亡。最近cao[2]等應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染方法將表達PDX-1的基因體外轉(zhuǎn)染肝細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高糖條件下肝

2、細胞被誘導(dǎo)分泌胰島素。這就提示，在一定條件下，胰島素在肝臟的異位表達是可以實現(xiàn)的。本實驗擬構(gòu)建pEGFP-NeuroD表達質(zhì)粒載體，體外轉(zhuǎn)染肝癌細胞（HepG2），觀察HepG2細胞在不同條件下NeuroD-1和胰島素的表達，從而探討體外表達NeuroD-1誘導(dǎo)肝癌細胞分泌胰島素的可能性。 實驗方法： 1.以重組質(zhì)粒Pcr3.1-NeuroD為模板，用PCR方法擴增出NeuroD-1基因，構(gòu)建入含增強綠色熒光蛋白的表達質(zhì)

3、粒pEGFP-Cl，構(gòu)建可以表達NeuroD-1基因的質(zhì)粒載體pEGFP-NeuroD。 2.將表達質(zhì)粒pEGFP-NeuroD用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染三種不同葡萄糖濃度培養(yǎng)的HepG2細胞，熒光顯微鏡下觀測綠色熒光蛋白的表達；利用RT-PCR方法檢測NeuroD-1及胰島素的表達；用Western Blot檢測NeuroD-EGFP融合蛋白的表達。 實驗結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了pEGFP-NeuroD表達質(zhì)粒。 2

4、.重組質(zhì)粒體外成功轉(zhuǎn)染入HepG2細胞，在熒光顯微鏡下可見強綠色熒光蛋白的表達，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率在30～40％之間；RT-PCR方法及Western Blot在三種不同葡萄糖濃度培養(yǎng)的HepG2細胞組中均檢測到NeuroD-1的表達，其中RT-PCR方法擴增出NeuroD-1 mRNA大小是634bp，NeuroD-EGFP融合蛋白Mr大小67×103，但是三組間基因表達量均無明顯差異。 3.RT-PCR法未檢測到肝癌細胞胰島素的