新型可復(fù)制型腎癌治療性DNA疫苗的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、研究背景:
　　腎癌是當(dāng)今社會(huì)人們面臨的危害人類健康的重要疾病,特別是對(duì)失去手術(shù)機(jī)會(huì)的轉(zhuǎn)移性腎癌目前還沒有令人滿意的治療方法,其他方法諸如放療,化療或內(nèi)分泌治療對(duì)腎癌治療效果比較局限,細(xì)胞因子等雖然會(huì)對(duì)部分病人有療效,但是強(qiáng)烈的毒副作用影響了它的應(yīng)用。因此,晚期腎癌的治療迫切需要新的更加有效的治療方法。
　　研究目的:
　　本研究是將腎癌G250抗原與一種基于塞姆利基森林病毒(SFV)的載體共同構(gòu)建成為新型的腎癌疫苗p

2、SVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7,并構(gòu)建表達(dá)人G250基因的renca細(xì)胞系小鼠荷瘤模型,為后續(xù)的抑瘤活性研究及免疫學(xué)機(jī)制研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1,將本室驗(yàn)證具有良好抗腫瘤活性的DNA疫苗中克隆出異種化G250融合基因片段,克隆入pSVK載體,構(gòu)建成新型的可復(fù)制型腎癌治療性DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7。質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后用We

3、sternBlot驗(yàn)證其在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)能力,通過肌肉注射加上電脈沖刺激的方法免疫小鼠,剝?nèi)∶庖卟课患∪饨M織進(jìn)行免疫組化分析,對(duì)其活體內(nèi)抗原的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2,采用PCR擴(kuò)增出人的G250基因編碼區(qū)長(zhǎng)度的互補(bǔ)序列,根據(jù)DNA重組技術(shù)定向插入到pIRES-neo真核表達(dá)載體中,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-neo-G250。用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將該質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到小鼠renca細(xì)胞中,通過調(diào)整G418的濃度篩選出陽性的克隆,

4、用蛋白免疫印跡和免疫熒光測(cè)試驗(yàn)證人G250基因轉(zhuǎn)染小鼠renca細(xì)胞株后的表達(dá)情況,利用上述細(xì)胞株分別以不同的濃度接種Balb/c小鼠,觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源基因后renca細(xì)胞的致瘤能力,建立表達(dá)人G250的小鼠腎癌模型。
　　結(jié)果:
　　(1)成功構(gòu)建了新型可復(fù)制型腎癌治療性DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7,利用westernblot及免疫組化的方法對(duì)該疫苗的體內(nèi)外表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果

5、表明有良好的表達(dá)。(2)成功篩選出了穩(wěn)定表達(dá)人G250基因的小鼠renca細(xì)胞株,利用westernblot,RT-PCR,流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光法檢測(cè)了抗原分子的表達(dá),并建立了表達(dá)人G250的小鼠腎癌模型,為后期研究新型可復(fù)制型腎癌治療性DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7的抑瘤作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　討論:
　　綜上所述,所構(gòu)建的新型可復(fù)制性抗腫瘤DNA疫苗pSVK-sig-tG25