乳腺癌CYP1B1表達(dá)與紫杉醇耐藥的相關(guān)性及應(yīng)用研究.pdf

1、目的：
　　 CYP1B1在某些腫瘤中特異性高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)量極低，且CYP1B1的存在會對某些抗腫瘤藥物產(chǎn)生影響，降低腫瘤細(xì)胞對特定抗腫瘤藥物的敏感性，因此，本課題的研究目標(biāo)是探討CYP1B1的表達(dá)對腫瘤抗藥性的影響，克隆構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CYP1B1的真核表達(dá)載體，以期建立不同腫瘤細(xì)胞的藥物篩選平臺，利用CYP1B1對抗腫瘤藥物的影響，指導(dǎo)臨床用藥，同時研制腫瘤組織CYP1B1表達(dá)的免疫組化檢測試劑盒，并初步應(yīng)用

2、于乳腺癌組織CYP1B1表達(dá)的檢測，為腫瘤的診斷和治療提供新的指標(biāo)和依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、TCDD誘導(dǎo)MCF-7表達(dá)CYP1B1后對紫杉醇細(xì)胞毒效應(yīng)的影響
　　 采用4個不同濃度的TCDD溶液（1、2、4、8nmol/L）誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞，利用RT-PCR技術(shù)測定誘導(dǎo)后CYP1B1 mRNA水平的表達(dá)情況，采用蛋白印跡及細(xì)胞免疫組化技術(shù)測定誘導(dǎo)后CYP1B1蛋白水平的表達(dá)情況。根據(jù)CYP1B1的表達(dá)結(jié)

3、果，選擇8nmol/L的TCDD溶液誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞表達(dá)出高水平的CYP1B1，分別用含有6種終濃度的紫杉醇溶液(0、0.001、0.01、0.1、10、30μg/ml)作用于有CYP1B1表達(dá)的MCF-7細(xì)胞，采用MTS比色法測定紫杉醇對MCF-7的細(xì)胞毒作用，判斷CYP1B1是否可導(dǎo)致紫杉醇細(xì)胞毒效應(yīng)的下降。
　　 2、CYP1B1的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 利用RT-PCR技術(shù)從MCF-7細(xì)胞中克隆CYP1

4、B1基因，采用BamHⅠ和SalⅠ酶雙酶切、T4 DNA酶連接的方式，將CYP1B1基因與真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP連接，并用EcoRⅠ酶切和DNA測序的方式對連接產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，構(gòu)建CYP1B1真核重組表達(dá)載體pIRES2-EGFP-CYP1B1。
　　 3、CYP1B1免疫組化診斷試劑的研制及乳腺癌組織的初步應(yīng)用
　　 選擇并合成CYP1B1特異性肽段，以此為免疫原對家兔進(jìn)行免疫，獲得抗CYP1B1的特異性抗體

5、，將免疫血清純化后采用ELISA法對其抗體效價進(jìn)行測定。將成功制備的兔抗CYP1B1抗體作為一抗，經(jīng)過對免疫組化條件的篩選與優(yōu)化，建立起免疫組化檢測腫瘤組織CYP1B1表達(dá)的方法，并初步應(yīng)用于乳腺癌組織標(biāo)本的檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1、TCDD誘導(dǎo)MCF-7表達(dá)CYP1B1后對紫杉醇細(xì)胞毒效應(yīng)的影響結(jié)果
　　 不同濃度的TCDD（1、2、4、8nmol/L）作用于MCF-7后，CYP1B1 mRNA的相對含量

6、與對照組相比均增強(qiáng)，且隨著TCDD濃度的增加，CYP1B1 mRNA的表達(dá)量也相應(yīng)增加。在對CYP1B1蛋白表達(dá)水平的檢測中可以得知，TCDD誘導(dǎo)后，細(xì)胞中CYP1B1的蛋白表達(dá)水平與mRNA的表達(dá)情況一致，即隨著TCDD濃度的增加，CYP1B1的蛋白表達(dá)量也相應(yīng)增加。
　　 將不同濃度的紫杉醇作用于經(jīng)過TCDD誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞后，對MCF-7細(xì)胞的生長抑制率與其作用于未經(jīng)TCDD誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞相比均有所下降，當(dāng)紫杉醇

7、濃度在0.01-0.1μg/ml時，兩組之間的差別更加明顯，說明在紫杉醇的有效治療濃度范圍內(nèi)，CYP1B1的存在降低了紫杉醇的細(xì)胞毒作用。
　　 2、真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-CYP1B1的構(gòu)建
　　 本實驗成功克隆出了CYP1B1目的基因，構(gòu)建了CYP1B1真核表達(dá)載體，可以將重組子轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞，使CYP1B1穩(wěn)定表達(dá)，進(jìn)一步研究CYP1B1與抗腫瘤藥物的關(guān)系，建立不同腫瘤細(xì)胞的藥物篩選平臺，通過CYP1B

8、1對抗腫瘤藥物的影響指導(dǎo)腫瘤患者的個性化治療。
　　 3、CYP1B1免疫組化檢測方法的建立與乳腺癌組織的初步應(yīng)用
　　 成功制備了抗CYP1B1的免疫血清，經(jīng)過測定，其抗體效價達(dá)到1∶128。經(jīng)過多次重復(fù)實驗的篩選，確定了免疫組化中的若干重要條件，建立了檢測腫瘤組織CYP1B1表達(dá)的免疫組化方法，將其初步應(yīng)用于乳腺癌組織的檢測后，成功的在乳腺癌組織中檢測出了CYP1B1的表達(dá)，初步驗證了CYP1B1在腫瘤組織中特異性表

9、達(dá)這一研究結(jié)果，為腫瘤的診斷與藥物治療提供了參考與依據(jù)。
　　 結(jié)論：
　　 1、TCDD能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞表達(dá)CYP1B1，且在一定濃度范圍內(nèi)，CYP1B1的表達(dá)水平隨著TCDD濃度的升高而增加;MCF-7細(xì)胞表達(dá)CYP1B1后能夠抑制紫杉醇的細(xì)胞毒作用。
　　 2、成功克隆并構(gòu)建了CYP1B1的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-CYP1B1，為進(jìn)一步研究CYP1B1的功能及其與抗腫瘤藥物的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)