基于幾丁質(zhì)酶阻斷的生物活性物質(zhì)的分離純化及其活性研究.pdf

1、幾丁質(zhì)酶在多種昆蟲和真菌的生長和發(fā)育過程中起重要作用，最近研究表明，幾丁質(zhì)酶還與哺乳動物哮喘病、動脈粥樣硬化等疾病密切相關(guān)，開發(fā)以幾丁質(zhì)酶為靶標的新型生物殺蟲劑、抗真菌劑和相關(guān)治療藥物引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。
　　本論文建立在具有幾丁質(zhì)酶抑制活性的菌種庫基礎(chǔ)之上，以家蠶幾丁質(zhì)酶為靶標，平板透明圈法初篩和DNS比色法復篩為篩選模型，篩選出高活性菌株A0101和B2-9，對其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶抑制劑進行分離純化及性質(zhì)研究。
　　菌株A01

2、01是一株放線菌，第2-3天處于對數(shù)生長期，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶抑制劑最佳時間在第6天。通過活性追蹤的方法對菌株A0101發(fā)酵產(chǎn)物進行分離純化，經(jīng)乙醇醇沉、透析、硅膠柱層析及SephadexG-15凝膠柱層析得到活性物質(zhì)純品，HPLC檢測顯示在保留時間4.1min為一單峰，DNS比色法驗證其抑制率為80.2％，紅外、核磁共振(1H-NMR)、質(zhì)譜初步證明其為一個多羥基的糖類化合物。為進一步提高發(fā)酵產(chǎn)率，對其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶抑制劑發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果:可溶性

3、淀粉為碳源，KNO3為氮源，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH7.0，最適溫度29℃，接種量為4％，培養(yǎng)時間6d，轉(zhuǎn)速250r/min。
　　菌株A0101所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶抑制劑性質(zhì)有:在pH2-11范圍內(nèi)，溫度40-90℃之間，抑制劑有良好的溫度及酸堿穩(wěn)定性;Cu2+和Zn2+對抑制劑的活力有促進作用，Mn2+對其有阻遏作用，其他離子基本沒有影響;抗菌譜實驗表明:該抑制劑是一種廣譜抑菌劑，對酵母、霉菌、大腸桿菌都有一定的抑制作用。
　　菌株

4、B2-9是一株革蘭氏陽性桿狀細菌，生長曲線測定實驗表明，3-9h菌株處于對數(shù)生長期，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶抑制劑最佳時間在15-21h期間。發(fā)酵液依次經(jīng)過有機溶劑浸提、DEAE-52柱層析、陽離子交換柱層析、半制備C18柱層析、SephadexG-25凝膠柱層析等分離純化步驟，經(jīng)HPLC檢測得到一個保留時間5.9min、純度89.6％的化合物。該化合物具有良好的溫度和pH耐受性，性質(zhì)穩(wěn)定。
　　本課題所篩選出的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶抑制劑活性菌株及相關(guān)性