地塞米松對哮喘小鼠肺組織中TWEAK及其受體Fn14表達(dá)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景：
　　 支氣管哮喘（簡稱哮喘）(bronchial asthma，asthma)是一種常見病、多發(fā)病，由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾患。慢性炎癥對氣道的持續(xù)性損傷和機(jī)體對損傷性刺激的修復(fù)性反應(yīng)所引起的氣道組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)，造成持續(xù)性氣流受限、肺功能下降、氣道高反應(yīng)性，從而引起一系列哮喘的臨床癥狀。全球哮喘控制現(xiàn)狀仍然十分嚴(yán)峻，有調(diào)查報(bào)告說，迄今亞太地區(qū)哮喘病的控制率僅3％，歐洲也只有5％的患者可達(dá)到哮喘控制。哮喘未

2、控制會(huì)嚴(yán)重影響患者日常生活，并造成急性加重時(shí)醫(yī)療資源的占用，進(jìn)而成為沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。然而哮喘的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，哮喘的防治仍是一大難題。因此探討哮喘的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)成為一項(xiàng)至關(guān)重要的任務(wù)。
　　 近年來提出哮喘的本質(zhì)是氣道慢性炎癥，氣道炎癥貫穿哮喘整個(gè)病程。氣道炎癥涉及到炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子三者的相互作用。哮喘病人氣道內(nèi)浸潤的炎癥細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞。研究證實(shí)哮喘發(fā)

3、病機(jī)制中的主要效應(yīng)細(xì)胞是嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)，在哮喘患者的誘導(dǎo)痰、支氣管肺泡灌洗液、外周血中有大量的活化的EOS聚集。EOS浸潤引起的氣道炎癥，主要與EOS活化和釋放的顆粒蛋白有關(guān)，如主要堿性蛋白(major basic protein，MBP)能誘導(dǎo)IL-5、組胺等炎性因子的釋放從而介導(dǎo)氣道炎癥。已經(jīng)證實(shí)參與哮喘發(fā)病過程的細(xì)胞因子有IL-5、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth f

4、actorbeta，TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)。哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮重要角色的體細(xì)胞有氣道上皮、氣道平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，而細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)作用這些體細(xì)胞引起氣道發(fā)生病理性改變，如氣道上皮屏障破壞、氣道重構(gòu)、氣道反應(yīng)性增高。
　　 有關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示腫瘤壞死因子樣弱凋

5、亡誘導(dǎo)因子(tumor necrosisfactor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)通過與其受體成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)早期反應(yīng)蛋白14(fibroblast growth factor-inducibleimmediate-early response protein14，F(xiàn)N14)結(jié)合后發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，包括促進(jìn)炎癥發(fā)生、血管生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、增殖、凋亡。TWEAK是TNF-α生長因子家

6、族中的一員，是一種Ⅱ型跨膜蛋白，能水解為長度為156個(gè)氨基酸的可溶性細(xì)胞因子發(fā)揮作用。而FN14是與TWEAK具有生物學(xué)親和力的受體，是一種Ⅰ型跨膜蛋白，包含一個(gè)富含半胱氨酸的胞外區(qū)和一個(gè)包含腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)結(jié)合基序的短胞內(nèi)區(qū)。而TWEAK/FN14的相互作用是通過與TRAF分子結(jié)合激活兩條NF-κ B信號(hào)通路:ⅠκBα

7、磷酸化和P100程序化。眾所周知NF-κ B是免疫和炎癥反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)一個(gè)廣泛的快速反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，通過表達(dá)細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞粘附分子、生長因子和免疫受體，在免疫球蛋白介導(dǎo)的疾?。ㄈ缦┲邪l(fā)揮作用。TWEAK可以在多種組織和細(xì)胞上表達(dá)，高度表達(dá)在炎癥細(xì)胞，包括活化的T細(xì)胞、分葉核的白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞;而FN14在正常條件下表達(dá)水平相對較低，有趣的是FN14在組織損傷與修復(fù)區(qū)域、慢性炎癥疾病高度表達(dá)，這也證實(shí)

8、了TWEAK/FN14協(xié)調(diào)急性炎癥中組織修復(fù)的生理性作用，而慢性炎癥疾病中發(fā)揮病理性作用。既往有報(bào)道指出，TWEAK/Fn14也參與了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、腎臟損傷、中風(fēng)、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和變性、腫瘤、心功能衰竭的病理過程。TWEAK還可以作為一些疾病的治療效果和早期診斷的生物標(biāo)記，比如腎臟損傷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，動(dòng)脈粥樣硬化。
　　 綜上，我們發(fā)現(xiàn)TWEAK/FN14相互作用可以調(diào)節(jié)一些組織的炎癥反應(yīng)。國外研究

9、發(fā)現(xiàn)TWEAK/FN14相互作用能刺激人支氣管上皮細(xì)胞釋放IL-8，GM-CSF，加重氣道的炎癥，用抗FN14單抗能阻止這些炎癥因子的釋放。TWEAK通過激活NF-KB途徑，誘導(dǎo)人腎臟細(xì)胞表達(dá)多種炎癥調(diào)節(jié)因子，如MCP-1，IP-10，MIP-1a，ICAM-1，VCAM-1，并能刺激體外與體內(nèi)腎臟細(xì)胞的增殖。通過免疫組化發(fā)現(xiàn)在炎癥性肺病患者肺組織和肺泡灌洗液中有TWEAK的表達(dá)，說明TWEAK/FN14的相互作用與肺部炎癥性疾病息息相

10、關(guān)，本研究主要探討TWEAK/FN14在哮喘病理生理過程的作用。
　　 目的：
　　 1、觀察TWEAK在哮喘小鼠肺組織中的表達(dá)及分布。
　　 2、觀察FN14在哮喘組小鼠肺組織中的表達(dá)及分布。
　　 3、探討地塞米松對哮喘小鼠肺組織中TWEAK表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　 4、探討地塞米松對哮喘小鼠肺組織中FN14表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　 材料和方法：
　　 1、雌性BALB/C SPF

11、級(jí)小鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　 2、哮喘小鼠模型構(gòu)建及分組:SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠36只隨機(jī)分為正常對照組、哮喘組和地塞米松治療組，每組12只。哮喘組于第1天和第14天腹腔及皮下注射OVA氫氧化鋁混懸液0.2mL[含OVA10μg，AL(OH)3100μ1]致敏，第21天開始霧化吸入50 g/L的OVA溶液激發(fā)30min，每周3次，連續(xù)8周;地塞米松治療組致敏同哮喘組，于第21 d開始霧化吸入50 g/LOV

12、A，激發(fā)前30 min腹腔注射地塞米松(10 mg/kg);正常對照組用生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。
　　 3、TWEAK及其受體FN14在各組小鼠肺組織中mRNA表達(dá):各組小鼠末次激發(fā)24h后，麻醉后結(jié)扎右側(cè)支氣管，左肺行肺泡灌洗，支氣管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid，BALF)收集離心后取上清，沉淀物涂片染色顯微鏡下行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。取右側(cè)肺組織提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄為eDNA，采用逆轉(zhuǎn)錄

13、聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測TWEAK及FN14在各組小鼠肺組織中的表達(dá)。
　　 4、通過免疫組化檢測TWEAK及其受體FN14在各組小鼠肺組織中的蛋白表達(dá)及分布:各組小鼠左側(cè)肺組織石蠟包埋切片后，行HE染色及免疫組化檢測TWEAK及FN14。用ImagePro Plus6.0軟件對陽性區(qū)域的平均光密度值行圖像分析(平均光密度值=積分光密度值(IOD sum)/陽性區(qū)域總面積(area sum)。
　　 5、west

14、ern blot檢測各組肺組織中TWEAK及FN14蛋白的表達(dá)水平。各組小鼠肺組織提取組織蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、加抗體孵育、顯色后拍照，用Gel-Pro Analyzer4圖像軟件分析各條帶灰度值，測出目的蛋白的表達(dá)強(qiáng)度（相對灰度值=目的蛋白表達(dá)強(qiáng)度/內(nèi)參表達(dá)強(qiáng)度）。
　　 6、采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。兩樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因

15、素方差分析(Oneway ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法;若方差不齊，采用校正的F檢驗(yàn)（Welch法），并選用Dunnet T3法。P＜0.05，p＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、用OVA激發(fā)后發(fā)現(xiàn)，哮喘組小鼠出現(xiàn)煩躁不安、喘息、呼吸急促、大小便失禁，對照組小鼠無異常，地塞米松組也出現(xiàn)哮喘組的癥狀，但癥狀較輕。
　　 2、HE染色結(jié)果，對照組氣管上皮完整，管腔正常，無支氣管痙攣、

16、支氣管狹窄，無炎癥細(xì)胞浸潤。哮喘組小鼠的支氣管狹窄，管腔內(nèi)可見粘液栓，支氣管痙攣，粘膜下、肺泡間質(zhì)中可見大量以EOS為主的炎癥細(xì)胞浸潤，血管周圍尤為顯著，氣道上皮細(xì)胞脫落。較哮喘組,地塞米松組支氣管粘膜上皮、管壁結(jié)構(gòu)較完整，管腔有輕度破壞，以EOS浸潤為主的炎癥細(xì)胞明顯較少。
　　 3、肺泡灌洗液細(xì)胞分析結(jié)果顯示各組BALF中的細(xì)胞總數(shù)分別為:8.42±2.12，22.12±5.54，14.89±3.20，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)分別為:

17、0.03±0.02，4.88±1.24，1.06±0.32，淋巴細(xì)胞數(shù)分別為:0.34±0.11，1.75±0.40，0.94±0.33。由此可見，哮喘組、地塞米松組BALF的細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均較對照組明顯增多（F=40.09，F(xiàn)=149.35，F(xiàn)=76.51，P值均小于0.01），地塞米松組較哮喘組細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少（F=40.09，F(xiàn)=149.35，F(xiàn)=76.51，P值均小于0.01）。

18、r>　　 4、實(shí)時(shí)定量PCR示，各組TWEAK mRNA的表達(dá)量分別為:1.01±0.10，2.35±0.12，1.52±0.12，F(xiàn)N14 mRNA的表達(dá)量分別為:1.01±0.10，3.48±0.24，2.30±0.19。由此可以看出，哮喘組、地塞米松組小鼠肺組織中TWEAK及FN14mRNA的表達(dá)均較對照組顯著升高(F=417.03，F(xiàn)=523.16，P＜0.01)，而地塞米松組較哮喘組TWEAK及FN14mRNA的表達(dá)顯著降低

19、(F=417.03，F(xiàn)=523.16，P＜0.01)。
　　 5、免疫組化結(jié)果顯示，各組TWEAK蛋白的表達(dá)量分別為:0.14±0.19，0.47±0.23，0.26±0.24，F(xiàn)N14蛋白的表達(dá)量分別為:0.18±0.02，0.57±0.03，0.28±0.03。由此可以看出，哮喘組、地塞米松組TWEAK的蛋白表達(dá)量較對照組有明顯增加(F=672.14，P＜0.01)，主要表達(dá)在小鼠肺組織氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞。

20、地塞米松組TWEAK的蛋白表達(dá)量較哮喘組有明顯減少(F=672.14，P＜0.01)。哮喘組、地塞米松組小鼠肺組織中Fn14蛋白的表達(dá)量較對照組明顯升高(F=676.33，P＜0.01)，主要在小鼠肺組織氣道上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮、血管平滑肌表達(dá)，而地塞米松組FN14的蛋白表達(dá)量較哮喘組有明顯降低(F=676.33，P＜0.01)。
　　 6、Western blot顯示，各組的TWEAK/內(nèi)參灰度比值分別為:0.22±0.06，0

21、.72±0.08，0.35±0.05; FN14/內(nèi)參灰度比值分別為:0.42±0.06，1.09±0.15，0.62±0.09。哮喘組、地塞米松組TWEAK的蛋白表達(dá)量較對照組有明顯增加(F=145.91，P＜0.01)，地塞米松組TWEAK的蛋白表達(dá)量較哮喘組有明顯減少(F=145.91，P＜0.01)。哮喘組、地塞米松組小鼠肺組織中Fn14蛋白的表達(dá)量較對照組明顯升高(F=97.25，P＜0.01)，而地塞米松組FN14的蛋白表達(dá)