志賀菌臨床株耐藥性分析及對(duì)氟喹諾酮類抗生素耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、志賀菌是細(xì)菌性痢疾(簡(jiǎn)稱菌痢)的病原體，從發(fā)現(xiàn)至今已有百余年的歷史。志賀菌感染目前仍是全球影響公共衛(wèi)生健康的重要問題。在中國(guó)，細(xì)菌性痢疾每年的發(fā)病數(shù)接近50萬(wàn)，發(fā)病率居37種監(jiān)測(cè)感染性疾病的前幾位，對(duì)公眾健康造成嚴(yán)重威脅?？股貞?yīng)用于細(xì)菌性痢疾的治療以后，耐藥率逐年上升。上世紀(jì)七十年代喹諾酮類藥物開始應(yīng)用于臨床并且已成為當(dāng)前治療細(xì)菌性痢疾的首選用藥。但是，隨著該類藥物的廣泛應(yīng)用，近年來(lái)耐藥問題日益嚴(yán)重。
　　研究目的：為了解天津地

2、區(qū)近三年來(lái)志賀菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥情況及探討對(duì)氟喹諾酮的耐藥機(jī)制，本課題選取2009年-2011年天津地區(qū)三家三級(jí)甲等醫(yī)院腸道門診分離的志賀菌臨床株，進(jìn)行血清學(xué)分型及抗生素藥敏試驗(yàn)，并對(duì)氟喹諾酮耐藥株從染色體靶位酶基因突變及質(zhì)粒介導(dǎo)兩個(gè)方面探討其對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制。
　　材料與方法：收集白天津市三家三級(jí)甲等醫(yī)院2009年、2010年及2011年5月-9月腸道門診患者糞便標(biāo)本的志賀菌臨床株139株，采用血清凝集法鑒定其

3、血清學(xué)分群及分型，明確本地區(qū)優(yōu)勢(shì)流行血清型。采用K-B紙片擴(kuò)散法用17種臨床常用抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分析并比較志賀菌不同血清群對(duì)不同抗菌藥物的耐藥程度。其中采用環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等4種抗生素篩選氟喹諾酮類耐藥株，并通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)氟喹諾酮耐藥志賀菌的gyrA、parC基因及所有菌株的qnrA、qnrB、qnrS、aac(6’)-Ib-cr、qepA基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Genebank上進(jìn)行比對(duì)。將PMQR基因陽(yáng)性菌株與大

4、腸埃希菌J53 ARZ進(jìn)行質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)，采用微量肉湯稀釋法比較受體菌對(duì)抗菌藥物的敏感性變化。對(duì)供體菌、受體菌及接合菌提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒圖譜分析及特異性PCR擴(kuò)增確認(rèn)含PMQR基因質(zhì)粒成功導(dǎo)入受體菌。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、經(jīng)常規(guī)生化及血清凝集實(shí)驗(yàn)證實(shí)，139株志賀菌包括福氏志賀菌17株(包括1a、2a、2b、4、5b、6及X、Y變種)，宋內(nèi)志賀菌121株及鮑氏志賀菌1株。天津地區(qū)近三年志賀菌主要流行血清群為宋內(nèi)志賀菌，其次為福氏志賀菌

5、F2a。藥敏結(jié)果顯示：139株志賀菌對(duì)一代喹諾酮萘啶酸敏感率最低，為1.44％，其次是氨芐西林、復(fù)方磺胺甲噁唑和鏈霉素，敏感率分別為2.22％、3.59％及4.32％，3種及3種以上抗生素多重耐藥菌株接近98％。福氏志賀菌與宋內(nèi)志賀菌對(duì)多種抗生素耐藥程度存在差異，對(duì)氟喹諾酮及三代頭孢耐藥程度明顯高于宋內(nèi)志賀菌。
　　2，本研究總共篩選出氟喹諾酮耐藥志賀菌5株，均為福氏志賀菌，耐藥率為3.59％(5/139)。宋內(nèi)志賀菌無(wú)氟喹諾酮耐

6、藥菌，但對(duì)萘啶酸耐藥程度較高。5株氟喹諾酮耐藥菌耐藥程度均較高，其中2株對(duì)左氧氟沙星同時(shí)耐藥。耐藥菌在gyrA、parC基因均有突變且突變基因及位點(diǎn)具有多態(tài)性，突變株中均有g(shù)yrA83(Ser→Leu)及parC80(Ser→Ile)位點(diǎn)突變，其中左氧氟沙星耐藥株N8與其余4株菌相比缺乏gyrA基因87位點(diǎn)突變，其余4株菌均同時(shí)存在 gyrA87(Asp→Gly、Asn)位點(diǎn)突變。139株志賀菌中共檢出4株P(guān)MOR基因陽(yáng)性株，1株qnr

7、S1陽(yáng)性菌N8為福氏志賀菌，對(duì)氟喹諾酮耐藥；3株aac(6’)-Ib-cr基因陽(yáng)性菌均為宋內(nèi)志賀菌，對(duì)氟喹諾酮敏感。通過(guò)質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)獲得3株接合株，提取質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)大小約10kb的質(zhì)粒從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌中，提取接合菌DNA均擴(kuò)增出了相應(yīng)PMQR基因，藥敏結(jié)果顯示qnrS1及aac(6’)-Ib-cr基因分別使受體菌在質(zhì)粒接合前后對(duì)環(huán)丙沙星和諾氟沙星的MIC分別提高了16、8和4、4個(gè)稀釋度，對(duì)左氧氟沙星和氧氟沙星的MIC分別提高了16、

8、8和1、4個(gè)稀釋度，但都達(dá)不到臨床意義的耐藥臨界值。進(jìn)一步印證了PMQR基因介導(dǎo)低水平耐藥的推斷，并提示qnr介導(dǎo)喹諾酮耐藥程度要高于aac(6’)-Ib-cr。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：本地區(qū)近3年志賀菌主要流行血清群為宋內(nèi)志賀菌，其次為福氏志賀菌F2a。志賀菌對(duì)多種抗生素耐藥率較高，且多重耐藥菌株比例高。福氏志賀菌與宋內(nèi)志賀菌對(duì)多種抗生素耐藥程度存在差異，對(duì)氟喹諾酮及三代頭孢耐藥程度明顯高于宋內(nèi)志賀菌。對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥率低于5％，且