以gp120為靶點(diǎn)的HIV進(jìn)入抑制劑的合成及篩選研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的疾病，嚴(yán)重威脅人類的生存，對(duì)人口健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響，全世界估計(jì)有3400萬(wàn)人感染艾滋病。艾滋病病毒的基因組比已知任何一種病毒基因都復(fù)雜，而且變化多樣。到目前為止，依然沒有一種疫苗可以付諸大規(guī)模使用。在今后相

2、當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)，發(fā)展安全有效的抗艾滋病藥物，依然是當(dāng)前艾滋病預(yù)防和治療的重點(diǎn)。
　　 迄今為止已有24種化合物實(shí)體和至少9種組合物被批準(zhǔn)用于臨床?？煞譃槟孓D(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、整合酶抑制劑和病毒進(jìn)入抑制劑四大類。前兩類藥物易誘導(dǎo)HIV耐藥性突變，而且對(duì)人體有較大的毒副作用，后兩類僅有3種化合物實(shí)體被批準(zhǔn)。
　　 HIV進(jìn)入抑制劑，盡管目前僅有Enfuvitide(T-20)和Maraviroc兩種，但它們對(duì)耐受前

3、兩類抗HIV藥物的病毒依然有效。并且，進(jìn)入抑制劑是作用在HIV感染的早期階段，能夠阻止HIV與靶細(xì)胞的融合，被認(rèn)為在艾滋病的防治上具有更好的應(yīng)用前景。開發(fā)新的阻止病毒進(jìn)入的抗HIV藥物也成為目前抗艾滋病藥物研究的熱點(diǎn)。
　　 HIV進(jìn)入靶細(xì)胞的過程主要由包膜蛋白(Envelope Proteins，Env)介導(dǎo)。在HIV進(jìn)入靶細(xì)胞過程中，首先是gp120與靶細(xì)胞上的CD4分子和輔助受體（趨化因子受體CCR5或CXCR4等）先后結(jié)

4、合，隨后跨膜亞基gp41的構(gòu)型發(fā)生改變，介導(dǎo)病毒包膜與靶細(xì)胞膜的融合，完成病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的感染過程。從病毒融合機(jī)制的角度，HIV進(jìn)入抑制劑可分為三大類，一是干擾gp120與CD4受體結(jié)合;二是拮抗輔助受體，阻止其與gp120-CD4復(fù)合物結(jié)合;第三類是阻止gp41核心結(jié)構(gòu)的形成，稱為HIV融合抑制劑。目前，針對(duì)HIV進(jìn)入抑制劑的研究主要集中在兩個(gè)方面:一是針對(duì)gp120為作用靶點(diǎn)，因?yàn)镠IV gp120與靶細(xì)胞上的CD4受體相結(jié)合是病

5、毒進(jìn)入靶細(xì)胞的第一步，如果能在病毒感染的第一步就進(jìn)行抑制，理論上則可對(duì)人體的危害性降到最低，有更好的應(yīng)用前景;二是針對(duì)gp41六螺旋束核心骨架的形成進(jìn)行抑制。
　　 作用于HIV gp120的進(jìn)入抑制劑主要為大分子的抑制劑和小分子的抑制劑兩大類。其中，大分子抑制劑主要為可溶性CD4及其衍生物以及靶向gp120的廣譜中和抗體兩大類;小分子的抑制劑主要以抑制gp120與CD4結(jié)合為靶點(diǎn)，或者以Phe43結(jié)合空腔為靶點(diǎn)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)主要

6、為BMS-378806、BMS-488043和NBD-556、NBD-557及其類似物。
　　 Zhou T等人從HIV感染者的血清中分離出兩個(gè)抗體，VRC01和VRC02，它們能夠抑制200多各種亞型HIV毒株中的90％，這是迄今為止分離得到的最廣譜、最有效的中和抗體。通過VRC01-gp120共結(jié)晶的單晶X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析，VRC01的結(jié)構(gòu)與CD4有一定的相似性，能部分地模擬CD4與gp120的結(jié)合。與CD4不同的是，VR

7、C01在CD4與gp120結(jié)合方向上偏轉(zhuǎn)了43°，并且離開了6(A)的距離。這使得VRC01既能結(jié)合于gp120上易受攻擊的CD4作用位點(diǎn)，又能克服gp120表面糖基及構(gòu)象的掩蓋作用。VRC01上CDR H2的Arg61能插入到gp120上V5與β24圍成的空腔中，并形成5個(gè)氫鍵的作用。Arg61結(jié)合靶穴可能是中和抗體具有廣譜、高效活性的重要作用靶點(diǎn)。如果化合物能結(jié)合在這一結(jié)合靶點(diǎn)，則可能具有較好地抗HIV感染的活性。這項(xiàng)研究為抑制HI

8、V的感染找到了座標(biāo)，使得研制艾滋病疫苗的目標(biāo)更加明確;同時(shí)，也為設(shè)計(jì)作用于gp120的小分子化合物找到了新的作用靶點(diǎn)，目前還未見報(bào)道作用于此靶點(diǎn)的小分子化合物。
　　 小分子進(jìn)入抑制劑研究方面:BMS-378806與BMS-488043結(jié)合在gp120上的CD4結(jié)合位點(diǎn)，從而阻止gp120與CD4的結(jié)合，其IC50為5 nmol/L。BMS-378806進(jìn)入了Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究，但因其抗病毒譜太窄被中止了進(jìn)一步的臨床研究。BMS-

9、488043進(jìn)入了Ⅱ期臨床研究，但因?yàn)閯┝肯鄬?duì)太大(1800 mg)而被暫停。針對(duì)BMS-378806所做的類似物的結(jié)構(gòu)改造工作并沒有取得很大的突破，目前還沒有藥物上市。NBD-556、NBD-557是本課題組大規(guī)模篩選33000個(gè)化合物的基礎(chǔ)上得到的兩個(gè)小分子化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)為N-苯基-N'-哌啶基草酰胺衍生物。作用機(jī)制研究表明，NBD-556能抑制gp120與CD4的結(jié)合，并且是特異性地作用于gp120，而不是受體CD4分子。NBD

10、-556能起到類似可溶性CD4的作用，結(jié)合到gp120上的CD4 Phe43結(jié)合口袋位置，誘導(dǎo)gp120發(fā)生構(gòu)象變化，使gp120形成輔助受體結(jié)合位點(diǎn)。NBD-556活性在μM級(jí)，如何進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，提高其抗HIV活性，以及對(duì)各種亞型HIV病毒株的廣譜抑制活性，是這類小分子化合物研究的關(guān)鍵。
　　 基于以上文獻(xiàn)報(bào)道，我們擬從以下兩方面進(jìn)行研究:
　　 一、基于Arg61結(jié)合靶穴的化合物庫(kù)虛擬篩選，并對(duì)虛擬篩選打分較高的化合

11、物進(jìn)行病毒活性測(cè)試。對(duì)活性化合物進(jìn)行作用機(jī)制研究，并對(duì)活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以期得到活性更好的化合物。
　　 二、基于Phe43結(jié)合靶穴的化合物結(jié)構(gòu)改造及活性篩選。主要是以NBD-556為先導(dǎo)物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，并設(shè)計(jì)合成系列類似物，對(duì)合成的類似物進(jìn)行抗HIV活性測(cè)試?？偨Y(jié)其構(gòu)效關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)廣譜、高效的小分子化合物。
　　 方法:
　　 對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的gp120-VRC01復(fù)合物的單晶結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。VRC01

12、的廣譜中和活性與其CDR H2的Arg61能插入到gp120上V5與β24序列圍成的空腔（Arg61靶穴）有關(guān)，我們首先在曙光W580I桌面超級(jí)計(jì)算機(jī)上，采用分子動(dòng)力學(xué)模擬，運(yùn)用MM-PBSA方法計(jì)算gp120與Arg61（位點(diǎn)1）以及VRC01的58-61序列（位點(diǎn)2）的結(jié)合自由能。利用分子對(duì)接方法，從庫(kù)容為40000的IBS天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)中虛擬篩選能與gp120上的位點(diǎn)1和位點(diǎn)2結(jié)合的化合物，并進(jìn)一步計(jì)算gp120與這些化合物的結(jié)合

13、自由能變化。對(duì)結(jié)合自由能降低較大的化合物進(jìn)行抗HIV假病毒及真病毒的活性篩選，確定先導(dǎo)化合物。最終篩選得到化合物NC-2，并對(duì)其抑制病毒感染活性的機(jī)制進(jìn)行研究。同時(shí)以NC-2為先導(dǎo)物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成系列類似物，并進(jìn)行活性篩選。
　　 (1)配體數(shù)據(jù)庫(kù):ibs2009oct_nc;受體:3NGB-A;位點(diǎn)1 Ag61，位點(diǎn)258到61號(hào)氨基酸序列。
　　 (2)用Surflex-Dock中基于配體的方法生成Prot

14、omol文件，利用分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)ibs2009oct_nc天然產(chǎn)物庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，得到同時(shí)與兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合打分較高的化合物。
　　 (3)計(jì)算打分較高的化合物與gp120結(jié)合的自由能變化情況，使用MM/PBSA的方法進(jìn)行計(jì)算。并與ΔGgp120-VRC01和ΔGgp120-CD4進(jìn)行比較。
　　 (4)對(duì)結(jié)合自由能變化較大的化合物購(gòu)買，并測(cè)試其抗HIV病毒感染的活性，得到小分子NC-2候選化合物。
　　 (5)由

15、于化合物NC-2有較好的抑制HIV假病毒與HIV-1ⅢB實(shí)驗(yàn)株活性，所以對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。通過細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，病毒-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，時(shí)間-過程實(shí)驗(yàn)，判斷NC-2是作用于HIV的進(jìn)入階段;通過抑制gp120與CD4的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，抑制gp41六螺旋束形成實(shí)驗(yàn)，研究其抑制HIV進(jìn)入的作用靶點(diǎn)。
　　 (6)以NC-2為先導(dǎo)物，進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，設(shè)計(jì)合成系列化合物，并進(jìn)行化學(xué)合成及抗HIV活性測(cè)試。
　　 目前文獻(xiàn)報(bào)道的NBD-

16、556類似物的改造，其活性并沒有明顯提高。對(duì)NBD-556化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，2，2，6，6-四甲基-哌啶基及中間的草酰胺連接骨架與其活性密切相關(guān)。因此，我們擬保留四甲基哌啶基，以及中間的草酰胺連接骨架，對(duì)其R取代基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，連接不同取代基的芳香環(huán)及雜環(huán)，并對(duì)合成的化合物抑制HIV感染的活性進(jìn)行研究。
　　 (1)以草酰二乙酯或草酰氯單乙酯為原料，通過酯的胺解反應(yīng)及取代反應(yīng)，合成系列NBD-556類似物。
　　 (2)

17、對(duì)合成的化合物，進(jìn)行抗HIV活性測(cè)試。
　　 結(jié)果:
　　 以Arg61結(jié)合靶穴為靶點(diǎn)進(jìn)行虛擬篩選:分別以Arg61，58到61號(hào)氨基酸序列作為兩個(gè)位點(diǎn)，對(duì)庫(kù)容為40000的ibs2009oct_nc天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選。先使用Surflex-Dock中基于配體的方法生成Protomol文件，使用12個(gè)CPU并行計(jì)算，其它參數(shù)使用默認(rèn)值。對(duì)接得到位點(diǎn)1得分大于8.0的化合物113個(gè)，位點(diǎn)2得分大于8.0的化合物180個(gè)

18、，其中有30個(gè)化合物既能與gp120上的位點(diǎn)1結(jié)合，也能與位點(diǎn)2結(jié)合，選取這30個(gè)化合物，進(jìn)行結(jié)合自由能的計(jì)算。
　　 體系中的結(jié)合自由能的計(jì)算采用MM/PBSA與MM/GBSA的方法，分別計(jì)算了候選的30個(gè)化合物與gp120結(jié)合后的自由能差，并與ΔGgp120-VRC01和ΔGgp120-CD4相比較。gp120與Arg61（位點(diǎn)1）結(jié)合自由能的變化為:PBTOT=-10.67，GBTOT=-13.89。gp120與58-61

19、序列（位點(diǎn)2）的結(jié)合自由能，PBTOT=-18.37，GBTOT=-16.27。其中，gp120與58-61序列的結(jié)合自由能降低值要大于gp120與Arg61結(jié)合自由能的降低值，說明58-61序列與gp120的結(jié)合能力要強(qiáng)于單一的氨基酸殘基Arg61與gp120的結(jié)合能力。gp120與CD4的結(jié)合自由能，PBTOT=-57.95，GBTOT=-23.77。gp120與VRC01的結(jié)合自由能，PBTOT=-113.62，GBTOT=-78

20、.88。通過計(jì)算可知，ΔGgp120-VRC01小于ΔGgp120-CD4，說明gp120與抗體VRC01的結(jié)合作用要強(qiáng)于gp120與CD4受體的結(jié)合，這個(gè)計(jì)算結(jié)果也能說明為什么VRC01結(jié)構(gòu)與CD4類似，卻具有更強(qiáng)效的中和能力，能阻止gp120與CD4結(jié)合。
　　 對(duì)侯選化合物與gp120結(jié)合自由能變化較大的19個(gè)化合物購(gòu)買，并用假病毒體系進(jìn)行抗HIV感染活性篩選。其中NC-2與NC-12有較好的抑制活性，并且這兩個(gè)化合物與g

21、p120結(jié)合自由能變化值也較大。NC-2抗HIV-1JRFL假病毒的IC50為10.58μM，抗HIV-1實(shí)驗(yàn)株HIV-1ⅢB的IC50為1.95μM。而且NC-2對(duì)靶細(xì)胞的毒性較小，其對(duì)U87.CD4.CCR5細(xì)胞的CC50為121.25μM，對(duì)MT-2細(xì)胞的CC50為17.23μM。NC-12雖然也具有一定的抗病毒感染的活性，但其抑制病毒感染IC50和對(duì)靶細(xì)胞毒性CC50接近，因此NC-12對(duì)細(xì)胞毒性較大。其抗病毒活性可能是由于細(xì)胞

22、毒性引起的。
　　 對(duì)NC-2抑制HIV感染的作用機(jī)制進(jìn)行研究。NC-2能抑制細(xì)胞-細(xì)胞融合，以及病毒-細(xì)胞融合，時(shí)間-過程實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)NC-2作用于HIV感染的進(jìn)入階段，且作用于HIV的包膜蛋白（統(tǒng)計(jì)學(xué)采用2因素析因分析方法，P＜0.001）。NC-2體外能抗gp120與CD4的結(jié)合，不能抑制gp41六螺旋束的形成（統(tǒng)計(jì)學(xué)采用單因素方差分析，多重比較LSD方法，P＜0.001）。說明NC-2可能是通過抑制HIVgp120與C

23、D4的結(jié)合，從而具有抑制HIV感染的作用。
　　 NC-2是天然產(chǎn)物中分離得到的，其來源有限，且活性在μM級(jí)。需要對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以期得到活性更好的小分子進(jìn)入抑制劑。對(duì)NC-2化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)了兩類化合物，并進(jìn)行化學(xué)合成。其中，合成了2-(3，4，5-三甲氧基)苯甲酰基-5-(苯乙炔基)噻吩類似物9個(gè)。對(duì)其進(jìn)行抗HIV假病毒活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)化合物7b和7c有抑制HIV-1JRFL假病毒感染的活性，其IC50分別為:21.3

24、6±0.78μM和15.14±6.27μM。
　　 以草酸二乙酯或草酰氯單乙酯為原料，通過酯的胺解反應(yīng)及取代反應(yīng)，合成系列NBD-556類似物8個(gè)。對(duì)其抗HIV活性進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后的化合物部分具有抗HIV假病毒感染的活性，但與NBD-556相比，活性沒有明顯提高。
　　 結(jié)論:
　　 以Arg61結(jié)合靶穴為靶點(diǎn)，通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選輔助病毒活性測(cè)試的方法，得到小分子化合物NC-2具有較好的抗HIV假病毒與

25、HIV-1ⅢB病毒的活性。經(jīng)作用機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)NC-2是作用于HIV感染的進(jìn)入階段，且作用靶點(diǎn)為HIV包膜蛋白。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，NC-2體外能抗gp120與CD4的結(jié)合，不能抑制gp41六螺旋束的形成。這與我們虛擬篩選的目的一致，說明Arg61結(jié)合靶穴是小分子化合物抗HIV感染的一個(gè)重要作用靶點(diǎn)。此篩選模型有一定的可信度，有可能用于其它化合物庫(kù)的大規(guī)模虛擬篩選。
　　 以NC-2為先導(dǎo)物，進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，已合成了2-(3，4

26、，5-三甲氧基)苯甲?；?5-(苯乙炔基)噻吩類似物9個(gè)?；钚詼y(cè)試結(jié)果表明，化合物7b和7c有抑制HIV-1JRFL假病毒感染的活性，其IC50分別為:21.36±0.78μM和15.14±6.27μM。另一個(gè)系列的化合物的合成也已取得了突破性的進(jìn)展。對(duì)其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及構(gòu)效關(guān)系研究，有可能得到活性更好的小分子化合物。
　　 以NBD-556為先導(dǎo)物，進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，合成了NBD-556系列類似物8個(gè)，抗HIV假病毒感染的活性表