不同來源Lfcin的抗腫瘤、抗炎癥及免疫調(diào)節(jié)作用的對比研究.pdf

1、牛乳鐵蛋白素(Bovine Lactoferricin，LfcinB)是牛乳中乳鐵蛋白在胃蛋白酶酸性環(huán)境水解產(chǎn)生的一種活性多肽，人乳鐵蛋白素(Human Lactoferricin，LfcinH)是人乳中乳鐵蛋白水解產(chǎn)生的一種活性多肽，國內(nèi)外主要研究LfcinB的生物活性，對LfcinH研究較少，本課題用不同質(zhì)量濃度的LfcinB和LfcinH分別對白血病細胞Jurkat、小鼠巨噬細胞、小鼠脾淋巴細胞作用，探討LfcinB和LfcinH

2、的抗腫瘤、抗炎癥及免疫調(diào)節(jié)作用并比較兩者的差異性和相關(guān)性，為將Lfcin開發(fā)成生物型抗腫瘤藥物、嬰兒配方奶粉和乳產(chǎn)品提供理論和實驗依據(jù)。
　　本研究采用MTT法檢測LfcinB和LfcinH對Jurkat細胞增殖影響;Hoechst33258染色法熒光顯微鏡觀察Jurkat細胞核的變化;運用AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記流式細胞術(shù)將LfcinB和LfcinH促進Jurkat細胞凋亡的階段進行區(qū)分;JC-1染色激光共聚焦顯微

3、鏡觀察細胞線粒體膜電位的改變;采用Griess法測定LfcinB和LfcinH對LPS刺激后的小鼠巨噬細胞釋放NO的含量;CCK-8法檢測LfcinB和LfcinH單獨作用對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響及與絲裂原共同作用對小鼠T、B淋巴細胞增殖作用的影響;ELISA法測定巨噬細胞釋放TNF-α的含量和淋巴細胞釋放IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的含量。
　　實驗研究結(jié)果如下:
　　(1)MTT結(jié)果顯示LfcinH和Lf

4、cinB對Jurkat細胞有顯著的抑制作用（P＜0.05），呈劑量依賴性;經(jīng)LfcinB和LfcinH處理后的Jurkat細胞在熒光顯微鏡下均可見細胞核皺縮、碎裂呈凋亡特征;激光共聚焦顯微鏡觀察到Jurkat細胞線粒體膜電位下降;流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Jurkat細胞經(jīng)LfcinB和LfcinH處理48h時主要發(fā)生早期凋亡。研究結(jié)果表明100～300μg/mL的LfcinB和LfcinH可顯著抑制Jurkat細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，150μ

5、g/mL的LfcinH和250μg/mL的LfcinB為抑制Jurkat細胞增殖的最佳作用濃度，推斷Jurkat細胞凋亡的機制可能是通過影響線粒體膜電位導(dǎo)致Jurkat細胞凋亡并抑制細胞增殖。
　　(2) Griess法和CCK-8結(jié)果顯示，LfcinB和LfcinH能顯著抑制LPS刺激后的Balb/c小鼠巨噬細胞釋放NO和TNF-α，呈劑量依賴性，與空白組相比具有顯著差異（P＜0.05）但均低于LPS對照組（1μg/mL的LPS

6、）。100μg/mL的LfcinH和150μg/mL的LfcinB為抑制巨噬細胞釋放NO和TNF-α的最佳作用濃度，LPS活化后可以誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生NO和促炎癥細胞因子TNF-α，推測LfcinB和LfcinH可能是通過抑制NO的釋放和促炎癥細胞因子TNF-α的分泌，避免機體組織受到損傷，達到了抗炎的目的。
　　(3)CCK-8結(jié)果顯示，LfcinB和LfcinH能有效的促進脾淋巴細胞的增殖，并與ConA、LPS對T、B淋巴細胞的

7、增殖有協(xié)同刺激作用，并且能顯著促進小鼠脾淋巴細胞體外分泌細胞因子IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α，與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05），研究結(jié)果表明LfcinB和LfcinH質(zhì)量濃度分別在為150μg/mL、100μg/mL與48h時脾淋巴細胞的增殖效果最佳，四種細胞因子的分泌量均達到最大，推測LfcinB和LfcinH可能是通過促進脾淋巴細胞增殖和誘導(dǎo)其分泌細胞因子，從而增強機體的免疫調(diào)節(jié)功能。
　　綜上所述，本研

8、究可以得出以下結(jié)論:LfcinB和LfcinH能夠抑制Jurkat細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，抑制LPS刺激后的Balb/c小鼠巨噬細胞釋放NO和分泌細胞因子TNF-α。及促進Balb/c小鼠脾淋巴細胞增殖，調(diào)節(jié)細胞因子IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的分泌水平，因此LfcinB和LfcinH起到了抗腫瘤、抗炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用，LfcinB與LfcinH在這三個功能性質(zhì)上具有同等功效，只是在劑量上稍有差別，本研究為下一步的體內(nèi)實驗打