TLR2-PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控肺炎衣原體感染誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移.pdf

1、研究目的:
　　利用肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae，C.pn)體外感染大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞(Vascularsmoothmusclecell，VSMC)模型；觀察C.pn感染對VSMC遷移能力的影響，研究磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase，PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Serine/threoninekinase，Akt)和Toll受體2(Tolllikereceptor

2、2，TLR2)-PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在C.pn感染誘導(dǎo)VSMC遷移中的作用，探討其相關(guān)分子機(jī)制。
　　內(nèi)容和方法:
　　1.C.pn增殖培養(yǎng)后體外感染大鼠原代VSMC；
　　2.C.pn感染VSMC后，利用透射電鏡(Ttransmissionelectronmicroscope，TEM)確定感染模型成功建立；
　　3.Wound-healing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)從二維和三維水平分別觀察C.pn感

3、染VSMC后其遷移能力的變化；
　　4.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢測C.pn感染后各組VSMCPI3KmRNA表達(dá)水平；
　　5.Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測C.pn感染VSMC后不同時間點(diǎn)Akt的磷酸化水平；
　　6.用PI3K特異性抑制劑LY294002抑制PI3K的活性，Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測各組VS

4、MC磷酸化Akt的表達(dá)變化，Wound-healing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察各組VSMC遷移能力的改變；
　　7.用TLR2中和抗體抑制TLR2的活性，Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測C.pn感染后各組VSMCAkt的磷酸化水平，確定TLR2在介導(dǎo)Cpn感染誘導(dǎo)PI3K/Akt磷酸化中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.C.pn感染VSMC后，透射電鏡下可見胞漿內(nèi)出現(xiàn)典型C.pn原體(Elementarybody，E

5、B)，提示Cpn感染VSMC模型成功建立；
　　2.Wound-healing實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cpn感染VSMC后，細(xì)胞向劃痕中央遷移的面積明顯大于正常對照組(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染組的細(xì)胞穿膜數(shù)明顯多于正常對照組(P<0.05)；
　　3.PI3K特異性抑制劑LY294002預(yù)處理VSMC后，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染組PI3KmRNA的條帶亮度與正常對照組相比較無明顯區(qū)別；

6、使用LY294002預(yù)處理的C.pn感染組VSMCPI3KmRNA的條帶與單純C.pn感染組對比，亮度也無明顯改變，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　4.分別于C.pn感染VSMC0h、15min、30min、1h、2h、3h、6h、12h和24h后提取總蛋白，Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VSMC30min后p-Akt表達(dá)水平開始升高；隨著感染時間延長，p-Akt表達(dá)水平逐漸升高，1h達(dá)到高峰，6h開始下降，并持續(xù)至2

7、4h；各組VSMC中總Akt表達(dá)水平無顯著差異；
　　5.Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用LY294002預(yù)處理的C.pn感染組VSMCp-Akt的條帶灰度較單純C.pn感染組明顯減弱(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組VSMC中總Akt條帶灰度無顯著差異；
　　6.Wound-healing實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LY294002預(yù)處理的C.pn感染組VSMC向劃痕中央遷移的面積明顯小于單純C.pn感染組(P<0.05)。

8、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LY294002預(yù)處理的C.pn感染組VSMC穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于單純C.pn感染組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　7.使用TLR2中和抗體預(yù)處理VSMC，Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VSMC后，用TLR2中和抗體預(yù)處理的C.pn感染組VSMC的p-Akt的條帶灰度較單純C.pn感染組減弱(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組VSMC中總Akt的條帶灰度無顯著差異。