RGD13肽抑制OPN誘導的血管平滑肌細胞黏附與遷移.pdf

1、目的：血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）具有收縮型與合成型兩種表型。血管損傷時，血流動力學發(fā)生改變及局部細胞因子釋放，管壁各層細胞成分發(fā)生變化，中膜VSMC由收縮型轉化為合成型，并大量增殖，導致管腔狹窄。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種分泌型的糖基化磷蛋白，是VSMC由收縮表型向合成表型轉化的標志。OPN通過RGD序列與細胞表面的多種整合素受體，如αvβ3、αvβ5，αvβ

2、1等相互作用而調節(jié)細胞黏附、遷移、增殖等多種生物學行為。而合成肽SVVYGLR已被證明在多種炎性反應如類風濕性關節(jié)炎中起治療作用。因此，我室設計合成具有以上兩種黏附基序的13肽分子-GRGDSVVYGLRSK-，以此作為誘騙寡肽阻斷OPN與整合素的相互作用，觀察其在OPN誘導的血管平滑肌細胞黏附與遷移中的抑制作用，并初步探討其機理。
　　 方法：通過黏附、遷移實驗觀察RGD13肽對細胞黏附、遷移活性的抑制效應；免疫熒光定位分析觀

3、察RGD對OPN誘導的VSMC黏著斑形成的影響；Western blot和免疫沉淀分析檢測RGD對OPN誘導的ILK去磷酸化的作用；RT-PCR、Western blot和酶圖分析檢測RGD對OPN誘導的MMP-2表達和活性的影響。
　　 結果：
　　 1 OPN和RGD對VSMC增殖活性的影響。
　　 MTT分析結果表明，不同濃度的OPN（20、40、80μg/mL）對VSMC增殖活性具有輕度的誘導作用，且呈劑

4、量依賴性。當用不同濃度的RGD13肽預孵育后，則OPN誘導的VSMC增殖活性被抑制。10μg/mL的RGD13肽可完全消除OPN的促增殖效應。
　　 2 RGD抑制OPN誘導的VSMC黏附。
　　 細胞黏附分析結果表明，OPN可劑量依賴性的提高VSMC的黏附活性，當OPN濃度達到20μg/mL時VSMC黏附活性較對照組有明顯升高（P<0.05）。用RGD預孵育VSMC1 h后，VSMC在OPN包被孔板上的黏附受到抑制；R

5、GD對細胞粘附活性的抑制效應具有劑量依賴性。結果提示，RGD可阻斷OPN誘導的VSMC黏附。
　　 3 RGD抑制OPN誘導的VSMC粘著斑形成。
　　 以整合素耦聯(lián)激酶（ILK）為標志物，用免疫熒光分析觀察黏著斑的形成，結果顯示，未經OPN處理的VSMC用ILK單克隆抗體進行免疫熒光染色后，胞質內出現散在點狀分布的細小熒光顆粒；細胞經20μg/mL OPN孵育5、10、30、60 min后，胞質內的熒光顆粒逐漸增多、形

6、成束狀整齊排列的黏著斑輪廓；用RGD（5μg/mL）預孵育1 h后再經OPN處理的VSMC，其胞質內熒光顆粒減少，熒光強度變弱，表明黏著斑形成受到抑制。
　　 4 RGD抑制OPN誘導的ILK去磷酸化作用。
　　 已經證實，在OPN促細胞黏附信號的跨膜轉導中，伴有ILK的脫磷酸化。免疫沉淀和Western印跡分析結果顯示，在靜止期細胞中ILK的蘇氨酸磷酸化水平較高，OPN刺激使其磷酸化程度下降，至30 min時降到最低，

7、與對照組比較，磷酸化的ILK降低55.4％。經過RGD預孵育1h后，隨著RGD濃度的增高，OPN誘導的ILK去磷酸化作用被消除。提示RGD可阻斷OPN信號的跨膜傳導。
　　 5 RGD抑制OPN誘導的VSMC遷移。
　　 傷口愈合實驗顯示，OPN可以提高VSMC的遷移活性。RGD預孵育后，OPN誘導的VSMC遷移被抑制；在所觀察的濃度范圍內，10μg/mL RGD對OPN誘導的VSMC遷移的抑制作用最強。與對照組相比，R

8、GD使VSMC平面遷移和跨膜遷移活性分別降低57％和52％。由此，RGD對OPN誘導的VSMC遷移具有顯著的抑制作用。
　　 6 OPN誘導MMP-2表達和活性。
　　 基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases2，MMP-2）在VSMC遷移中發(fā)揮著重要的作用，為了闡明OPN誘導VSMC遷移是否與調節(jié)MMP-2活性有關，我們檢測了OPN對該基因表達的影響。Western blot和RT-PCR

9、結果顯示，OPN可以劑量依賴性和時間依賴性地誘導MMP-2的表達。酶圖分析顯示，在同樣條件下，MMP-2酶活性也平行升高。結果表明，OPN誘導VSMC的遷移與提高MMP-2的表達和活性有關。
　　 7 RGD抑制OPN誘導的MMP-2表達和活性。
　　 Western blot和RT-PCR結果顯示，不同濃度的RGD預孵育VSMC1 h后，能夠消除OPN誘導的VSMC中MMP-2的表達。在所觀察的濃度范圍內，10μg/m

10、L ROD對OPN誘導的MMP-2表達的抑制作用最強。與對照組相比，RGD預處理后，OPN誘導的MMP-2的mRNA和蛋白表達水平分別降低了68％和59％。此外，酶圖分析可見，RGD預孵育也明顯降低MMP-2水解明膠的活性。結果提示，RGD抑制OPN誘導的VSMC遷移活性與降低MMP-2的表達和活性相關。
　　 結論：
　　 1 RGD可以劑量依賴性抑制OPN誘導的VSMC黏附。
　　 2 RGD抑制OPN誘導的