涎腺腺樣囊性癌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)及抑制研究.pdf

1、深入了解DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)在涎腺腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)DNA甲基化、抑癌基因沉默、腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及DNMTs與ACC生物學(xué)行為的相關(guān)性。 【方法】 應(yīng)用RT-RCR、Real Time PCR、免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色、western-blot方法檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1、3b(DNA methyltran

2、sferase 1、3b，DNMT 1、3b)在60例ACC臨床病理標(biāo)本、3株ACC細(xì)胞系細(xì)胞中的mRNA、蛋白表達(dá)水平及陽性表達(dá)程度，分析DNMT 1、3b與ACC抑癌基因甲基化、臨床分期、病理分級、細(xì)胞生長、增殖等生物學(xué)行為的相關(guān)性。 使用DNA非特異性甲基化抑制劑Decitabine處理ACC細(xì)胞系細(xì)胞，應(yīng)用Real Time PCR、western．blot分析藥物處理前后DNMT 1的表達(dá)差異，采用MSP、RT-PC

3、R方法檢測ACC細(xì)胞系細(xì)胞因甲基化而沉默的E-cadherin(CDH 1)基因的甲基化狀況及mRNA的表達(dá)變化。 應(yīng)用針對DNMT 1人工合成的siRNA處理ACC細(xì)胞系細(xì)胞，采用Real Time PCR、RT．PCR、western-blot瞬時(shí)檢測DNMT 1的表達(dá)抑制狀況，篩選有效的siRNA干擾序列，并分析DNMT 1siRNA干擾的時(shí)效和量效關(guān)系。 將構(gòu)建的針對DNMT 1基因的siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)

4、染ACC細(xì)胞，篩選陽性細(xì)胞克隆，采用Real Time PCR、western-blot方法評價(jià)DNMT 1表達(dá)抑制水平。 [結(jié)果] DNMT 1在ACC臨床病理標(biāo)本和細(xì)胞系的陽性表達(dá)程度明顯高于DNMT3b的陽性表達(dá)；DNMT l高、低表達(dá)組與抑癌基因高、低甲基化組之間有差異(P<0.05)，DNMT 1表達(dá)程度與RASSF1A基因的甲基化(P<0.01)、ACC病理分級(P<0.05)、臨床分期(P<0.01)呈正

5、相關(guān)。 經(jīng)Decitabine處理后，ACC-細(xì)胞DNMT 1的mRNA表達(dá)低于未處理組；原無mRNA表達(dá)的CDH 1基因啟動子甲基化程度下調(diào)，并檢測到基因mRNA的表達(dá)；藥物處理組細(xì)胞較未處理組生長減緩，細(xì)胞計(jì)數(shù)前者低于后者。 人工合成DNMT l-1siRNA處理ACC-2、ACC-3、ACC-M細(xì)胞24-48h后，經(jīng)Real Time PCR檢測，分別使DNMT 1的mRNA表達(dá)抑制67％、86％、92％，DN

6、_MT 1-2 siRNA分別抑制76％、76％、86％；ACC-M細(xì)胞系細(xì)胞出現(xiàn)DNMT 1抑制的時(shí)間為轉(zhuǎn)染后24h，ACC-2、ACC-3細(xì)胞系為轉(zhuǎn)染后48h，抑制作用隨轉(zhuǎn)染時(shí)間延長而快速衰減；RT-PCR、western-bl0t檢測結(jié)果與上述檢測結(jié)果相符合；隨DNMT l-1siRNA濃度的逐漸增加，ACC-3細(xì)胞DNMT 1 mRNA、蛋白表達(dá)逐漸降低。 DNMT 1 siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞后，篩選

7、出的陽性克隆細(xì)胞其DNMT l的mRNA、蛋白表達(dá)均低于空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞。 【結(jié)論】 DNMT 1可能是ACC體內(nèi)、外維持抑癌基因甲基化起主導(dǎo)作用的甲基化酶，與RAS SF 1 A、CDH 1基因的甲基化、ACC病理分級、臨床分期有相關(guān)性，有可能作為ACC生長、增殖、預(yù)后的評估指標(biāo)之一。 Decitabine通過下調(diào)DNMT 1的表達(dá)促使ACC細(xì)胞系細(xì)胞CDH 1基因去甲基化，基因開放表達(dá)，并抑制