動脈粥樣硬化斑塊中糜酶活性的實驗研究.pdf

1、背景 冠心病和腦卒中是嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，其病理基礎是動脈粥樣硬化(AS)。大量證據表明，在AS的形成和發(fā)展過程中，內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、肥大細胞等發(fā)揮了重要的作用。晚近的研究證實肥大細胞與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關。肥大細胞通過分泌多種炎癥介質，包括糜酶(chymase)、組胺和各種化學因子及細胞因子，誘導血管炎癥反應、內皮功能失調、泡沫細胞形成、胞外基質降解和微血管新生等，對AS斑塊的形成及斑

2、塊穩(wěn)定性起著重要作用。其中，肥大細胞分泌的糜酶與AS病程進展關系尤為密切。綜合研究表明，糜酶可能通過以下途徑促進AS的形成和發(fā)展過程：(1)通過介導非經典途徑激活血管組織中的腎素—血管緊張素系統(RAS)，引起血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)生成增加，促進AS病變的進展和斑塊易損；(2)通過水解活化多種炎性因子，促進AS的炎癥反應過程，加速AS的進展；(3)通過降解載脂蛋白AI(Apo-AI)，阻礙泡沫細胞的膽固醇外向轉運，引起胞內脂質淤積，導

3、致細胞壞死脂質沉積，促進AS斑塊的形成和發(fā)展；(4)直接蛋白水解斑塊纖維帽的基質成分，如：連接蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、Ⅳ型和Ⅴ型膠原，導致纖維帽變薄，促進斑塊向不穩(wěn)定方向轉變；(5)通過活化基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3和MMP-9，導致斑塊纖維帽的基質成分水解而影響斑塊的穩(wěn)定性；(6)通過活化多種炎性因子誘導斑塊血管平滑肌細胞(VSMC)凋亡并抑制其分泌活性，促進斑塊纖維帽變薄，降低斑塊穩(wěn)定性等；(7)通

4、過促進AngⅡ及內皮素-1(ET-1)等遞質的分泌，增加血管病變局部的血流剪切力，促進AS斑塊向不穩(wěn)定方向發(fā)展?？傊?，糜酶在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著極為重要的作用。 然而，目前糜酶活性的檢測方法尚無統一標準。國際上較多采用組織提取物加入含AngⅠ的反應體系，采用反相高效液相色譜技術(HPLC)檢測糜酶活性，但測量誤差較大。國內學者采用改良的AngⅠ反應體系，應用三種抑制劑分別抑制糜酶以外的其它AngⅠ水解酶的活性，運用減法原

5、則和放射免疫技術(RIA)檢測AngⅠ水解活性，用來表示糜酶和ACE活性，理論上較為合理。但是無論液相色譜技術或是放射免疫技術，由于操作過程中對血管組織進行高速勻漿和離心等，導致了糜酶與ACE活性損耗，引起肥大細胞胞漿內游離糜酶大量釋放，同時破壞了糜酶的復合體結構，造成檢測誤差，故而影響檢測的準確性。 易損斑塊破裂、急性血栓形成造成冠脈急性閉塞是急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndrome，ACS)的主要發(fā)病機制已

6、成為共識。尋求穩(wěn)定易損斑塊的靶點已成為國內外學者研究的重要方向。由于糜酶對AS的多重影響，導致AS斑塊纖維帽變薄、降低斑塊穩(wěn)定性而促進斑塊向易損性方向發(fā)展。糜酶已成為斑塊向易損方向發(fā)展的關鍵因素，能否通過阻斷糜酶活性進而促進斑塊的穩(wěn)定性，已引起國內外學者的重視。 由于糜酶結構功能存在很大的物種差異性，傳統用于AS研究的家兔、大鼠、小鼠和豬等動物不適用于模擬人類糜酶的研究，目前針對敘利亞倉鼠糜酶的基因敲除或沉默治療尚難以開展?，F階

7、段常用于抑制動物體內糜酶活性的藥物包括肥大細胞膜穩(wěn)定劑曲尼司特和一些特異性非肽類糜酶抑制劑(如BCEAB、SUN-C8257和NK3201)，但后者尚處于研究開發(fā)階段，相關的機制研究尚不明確，目前尚無公認的特異性糜酶抑制劑用于科研和臨床。Jin等首先研究證實曲尼司特可以高效地抑制血管組織中糜酶活性，阻斷糜酶介導的AngⅡ生成。隨后的大量研究證明，曲尼司特用于抑制糜酶活性的劑量應是常規(guī)劑量的10倍，曲尼司特可以顯著抑制血管移植及PTCA術

8、后血管糜酶活性。曲尼司特是一種過敏遞質阻釋劑，它可抑制肥大細胞的磷酸二酯酶，穩(wěn)定細胞膜，防止細胞脫顆粒和釋放糜酶等化學遞質，同時，還可以抑制肥大細胞增殖，使細胞停滯于G0/G1期，減少其數量，從而起到減少糜酶分泌進而發(fā)揮穩(wěn)定斑塊的治療作用。 縱觀國內外的研究成果，盡管目前在糜酶與AS病變的研究方面已取得了一定進展，但在糜酶與AS的相互關系的研究領域中仍存在許多重大問題亟待解決： (1)目前尚缺乏適用于前瞻性研究糜酶活性增

9、高對AS病變影響的動物模型。受糜酶結構功能物種差異性等因素的影響，糜酶與AS的在體研究尚停留停留在回顧性研究階段，缺乏適用于前瞻性研究糜酶激活對AS病變影響的模型。(2)如何建立檢測組織糜酶活性的可靠方法?目前糜酶活性的檢測方法尚不統一，常用的糜酶活性HPLC和RIA檢測法存在較大的缺陷，亟待建立可靠的檢測方法。(3)能否通過在體研究激活或抑制糜酶活性對AS病變的影響，進一步揭示血管糜酶在AS斑塊易損過程中的作用機制呢?(4)能否通過曲

10、尼司特抑制血管糜酶活性延緩AS病程的進展，進而增加斑塊的穩(wěn)定性，為糜酶作為治療靶點提供充分的理論依據? 以上問題構成本課題的設計思路和研究目的。 方法 1.AS斑塊糜酶活性的方法學研究 (1)AS模型的建立：120只8周齡雄性金黃敘利亞倉鼠，隨機分成正常對照組(A組)15只，AS斑塊組(B1組～B7組)每組15只共105只。A組采用普通飼料喂養(yǎng)，B1～B7組采用高脂飼料(0.5﹪膽固醇+10﹪豬油+89.

11、5﹪基礎飼料，每只12～15g.d-1)喂養(yǎng)12周。第12周末行血流動力學檢測，并在A組隨機處死1只倉鼠，檢驗腹主動脈無AS斑塊形成；在B1～B7組每組隨機處死1只倉鼠，驗證腹主動脈產生動脈粥樣硬化病變。 (2)抗原致敏：第13周初進行抗原致敏，取1ml卵白蛋白懸浮液(10﹪卵白蛋白+3﹪氫氧化鋁)對B2～B7組倉鼠雙側腋下及腹股溝皮下各注射0.15ml，腹腔注射0.4ml，聯合腹腔注射百日咳白喉破傷風三聯疫苗2ml(約含101

12、0百日咳菌株)，誘發(fā)倉鼠體內發(fā)生Ⅰ型超敏反應，產生IgE抗體，與肥大細胞特異性結合，致敏肥大細胞。對A組和B1組倉鼠注射等量生理鹽水假致敏，分別作為正常對照和高脂對照。 (3)抗原激發(fā)：第15周末，每組抽取半數倉鼠作為激發(fā)(假激發(fā))術前的自身對照，然后對B3～B7組剩余的半數倉鼠進行腹主動脈局部封閉注射卵白蛋白，誘導糜酶釋放：在髂總動脈以上的約2cm的腹主動脈段兩端結扎暫時阻斷血流10分鐘，于近心端沿動脈血流方向分別注射0.5﹪

13、、1﹪、2.5﹪、5﹪和10﹪的卵白蛋白懸浮液0.2ml(分別含1mg、2mg、5mg、10mg和20mg卵白蛋白)，激活血管組織中致敏的肥大細胞大量釋放糜酶。對假致敏的A組、B1組和致敏的B2組倉鼠實施假激發(fā)術(注射生理鹽水)。術后48小時處死剩余倉鼠。 2.AS斑塊糜酶活性的干預性研究 (1)AS模型：60只8周齡雄性金黃敘利亞倉鼠，隨機分成正常對照組(A組)15只，AS斑塊組(B1組～B3組)每組15只

14、共45只。A組采用普通飼料喂養(yǎng)，B1組～B3組采用高脂飼料喂養(yǎng)12周，每周末監(jiān)測體重。第12周術在A組隨機處死1只倉鼠，檢驗腹主動脈無AS斑塊形成；在B1組～B3組每組隨機處死1只倉鼠，驗證腹主動脈產生動脈粥樣硬化病變。 (2)糜酶活性干預：從第13周開始，對實驗倉鼠進行以下干預：對B2組倉鼠注射卵白蛋白懸液及三聯疫苗致敏其體內肥大細胞(同方法學研究)，每日給予蒸餾水灌胃，致敏3周后處死半數做激發(fā)術前自身對照，對剩余的倉鼠進行腹

15、主動脈局部封閉注射5mg卵白蛋白進行抗原激發(fā)(通過方法學研究所確定的劑量)，作為糜酶激活組；對B3組倉鼠注射安慰劑假致敏，每日給予肥大細胞活性抑制劑曲尼司特400mg/kg灌胃，3周后每組處死半數做假激發(fā)術前自身對照，對剩余倉鼠注射安慰劑實施假激活術，作為曲尼司特治療組；對A組和B1組倉鼠注射安慰劑(生理鹽水)假致敏，每日給予蒸餾水灌胃，3周后每組處死半數做假激發(fā)術前自身對照，對剩余倉鼠注射安慰劑實施假激活術，分別作為正常對照和高脂對照

16、。術后48小時處死各組剩余倉鼠。根據方法學研究所確定的血管體外灌流技術觀察血管的糜酶與ACE活性變化。 結論 1.本研究通過對卵白蛋白抗原預致敏的AS倉鼠實施局部血管段抗原攻擊的方法，有效地激活了該段AS血管的糜酶活性，成功地建立了適用于前瞻性觀察糜酶活性對AS病變影響的動物模型。 2.血管灌流技術克服了以往研究對細胞結構破壞的不足，具有保護組織細胞結構功能完整性的優(yōu)點，是研究糜酶活性較為理想的方法學。