腺苷A1受體介導的PI通路在酒精性肝纖維化大鼠星狀細胞模型中的作用.pdf

1、酒精性肝病是一種由于長期大量飲酒所導致的肝臟類疾病。其疾病譜較廣，從脂肪肝到肝硬化甚至肝癌，而酒精性肝纖維化是這個過程中重要的一環(huán)。如何預防甚至逆轉(zhuǎn)酒精性肝纖維化的發(fā)生已愈來愈受到關注。在酒精性肝纖維化發(fā)生過程中，酒精在肝臟中的代謝物乙醛可激活肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)，HSC的活化會刺激產(chǎn)生細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。因此，HSC的活化增殖是酒精性肝纖維化發(fā)生的

2、中心環(huán)節(jié)。
　　隨著對腺苷及其受體研究的逐步深入，人們認識到腺苷受體(adenosine receptor，AR)在肝臟疾病中發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究表明咖啡因作為非選擇性AR拮抗劑不僅能顯著抑制大鼠酒精性肝纖維化模型中肝纖維化的發(fā)生，同時內(nèi)外研究表明還能顯著抑制乙醛誘導的HSC活化。前期研究還顯示A1R和A2AR拮抗劑均可抑制酒精性肝纖維化中HSC的活化增殖但二者對cAMP-PKA-CREB通路有相反的調(diào)節(jié)作用，其中A2

3、AR所介導的cAMP-PKA-CREB通路作用占主導優(yōu)勢。
　　目前認為，在酒精依賴形成過程中，由G蛋白耦聯(lián)受體介導的cAMP信號通路和磷脂酰肌醇（PI）信號通路是介導酒精效應的細胞內(nèi)主要靶點，其中PI通路的關鍵信號分子DAG和PKC也均是調(diào)節(jié)細胞增殖的重要環(huán)節(jié)。所以，我們推測腺苷A1受體在酒精性肝纖維化中可能通過介導PI通路來調(diào)控HSC的活化增殖且與cAMP信號通路有信號交聯(lián)作用。為進一步驗證這一假設，本研究采用乙醛刺激HSC-

4、T6細胞建立酒精性肝纖維化HSC模型，在此基礎上觀察腺苷A1受體介導的PI通路在調(diào)控HSC活化增殖中的作用以及與cAMP-PKA信號通路的交聯(lián)作用。
　　研究內(nèi)容主要包括以下幾個部分：
　　1. A1R在酒精性肝纖維化細胞模型中表達增加
　　我們首先通過乙醛(200μM)刺激HSC-T648h建立酒精性肝纖維化模型，檢測其A1R的表達。Real Time PCR及Western blot結(jié)果顯示：正常組及肝纖維化模型組

5、中均有A1R表達且模型組中A1R mRNA和蛋白水平顯著高于正常組。
　　2. siRNA沉默A1R對HSC活化增殖的影響
　　實驗分為正常組、模型組、A1R siRNA組和陰性對照組。根據(jù)A1R基因序列設計并合成siRNA，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染進HSC中。MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組HSC活力顯著下降，表明沉默A1R可顯著抑制已活化的HSC活力。進一步采用Real Time PCR檢測α-SMA和Collagen I mRNA的表達，We

6、stern blot法檢測α-SMA和Collagen I蛋白的表達。實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組α-SMA、Collagen I mRNA及蛋白表達水平明顯降低，而陰性對照組表達無顯著差異，這表明靶向封閉A1R基因的表達可明顯抑制HSC-T6細胞的活化增殖。
　　3. AR介導的PI信號通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC中的作用
　　實驗分為正常組、模型組、UTP組(IP3的前體物質(zhì)，介導Ca2+釋放)、非選擇性AR激動劑NECA組和U

7、TP+NECA組。除正常組外，其余各組用乙醛(200μM)作用24h以制備大鼠酒精性肝纖維化 HSC模型。UTP組給予 UTP(100μM)處理24h，NECA組給予 NECA(10μM)處理24小時，UTP+NECA組同時給予UTP(100μM)和NECA(10μM)處理24小時。采用ELISA法檢測各組HSC內(nèi)IP3的含量，Western blot法檢測各組HSC內(nèi)PLC蛋白的表達。激光共聚焦顯微鏡檢測各組HSC胞內(nèi)Ca2+的表達。

8、結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組IP3含量、其信號中關鍵信號分子 PLC蛋白表達及胞內(nèi) Ca2+的表達明顯升高，同時 UTP組與NECA組結(jié)果較模型組顯著升高，且UTP預處理顯著增強NECA的效應。結(jié)果提示，在HSC存在PI信號通路。隨后進一步用Real Time PCR檢測α-SMA和Collagen I mRNA的表達，Western blot檢測α-SMA和Collagen I蛋白的表達。實驗結(jié)果顯示UTP組、NECA組和UTP+N

9、ECA組α-SMA、Collagen I mRNA及蛋白表達水平明顯升高，且UTP預處理顯著增強NECA的效應。這表明AR介導的PI通路在HSC細胞的活化增殖中有調(diào)節(jié)作用。
　　4. A1R介導的PI通路在A1R拮抗劑抑制HSC活化增殖中的作用
　　在前期研究中已發(fā)現(xiàn)A1R拮抗劑抑制HSC活化增殖的基礎上，為進一步闡明A1R介導的PI通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中的作用，實驗分為正常組、模型組、A1R激動劑CPA、A1

10、R拮抗劑DPCPX組和CPA+DPCPX組。除正常組外，其余各組用乙醛(200μM)作用24h以制備大鼠酒精性肝纖維化HSC模型。CPA組給予 CPA(1μM)處理24h，DPCPX組給予 DPCPX(10nM)處理24h，CPA+DPCPX組同時給予CPA(1μM)和DPCPX(10nM)處理24小時。采用激光共聚焦顯微鏡檢測各組HSC內(nèi)Ca2+的表達，ELISA法檢測各組HSC內(nèi)IP3、DAG的含量，Western blot法檢測各

11、組HSC內(nèi)PLC、PKC蛋白的表達。結(jié)果顯示，經(jīng)CPA處理后，模型組HSC中胞內(nèi)Ca2+的表達，IP3、DAG含量及PLC、PKC蛋白表達上升。而DPCPX作用后HSC中胞內(nèi)Ca2+的表達，IP3、DAG含量及PLC、PKC蛋白表達下降。同時，與單獨用藥組比較，CPA+DPCPX聯(lián)合用藥組上述作用均可逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明A1R調(diào)控的PI通路在乙醛誘導的HSC活化增殖中具有一定作用。
　　5. PLC-PKC信號通路與cAMP-PKA信號

12、通路的信號交聯(lián)
　　實驗分為正常組、模型組、PKC激動劑PMA組、PKC抑制劑SC-3088組共同孵育大鼠HSC，比較不同組別HSC活化增殖情況，采用Elisa法檢測各組HSC內(nèi)cAMP的含量，Western blot法檢測各組HSC內(nèi)PKA蛋白的表達?？疾霵KC活性的升高或降低對cAMP含量和PKA活性的影響。結(jié)果顯示PMA組α-SMA、Collagen I的表達、cAMP的含量和PKA蛋白的表達較模型組明顯增強，而經(jīng)SC-30

13、88處理后顯著下降。再將實驗分為正常組、模型組、PKA激動劑FSK組、PKA抑制劑H89組共同孵育大鼠HSC，比較不同組別HSC活化增殖情況，Western blot法檢測各組HSC內(nèi)PLC、PKC蛋白的表達?？疾霵KA活性的升高或降低對PLC、PKC活性的影響。結(jié)果顯示FSK組α-SMA、Collagen I的表達、PLC、PKC蛋白的表達較模型組明顯增強，而經(jīng)H89處理后顯著下降。闡明PLC-PKC信號通路與cAMP-PKA信號通路