高鹽滲濾液COD降解優(yōu)勢菌的篩選及相關基因消減文庫的構(gòu)建.pdf

1、濱海地區(qū)垃圾填埋場產(chǎn)生的滲濾液,不僅具有一般滲濾液的COD濃度高且生物難降解的特性,而且還含有較高的鹽量,常常使得生物處理工藝很難穩(wěn)定運行。本文從滲濾液中分離出多株優(yōu)勢菌,構(gòu)建優(yōu)勢菌群,通過生物強化技術,提高滲濾液生化處理效能。利用分子生物技術,鑒別優(yōu)勢菌株。利用抑制消減雜交技術,構(gòu)建優(yōu)勢菌株的消減文庫,為構(gòu)建垃圾滲濾液工程菌奠定基礎。
　　 本研究根據(jù)高鹽垃圾滲濾液的組成及特點,通過梯度增加培養(yǎng)基中垃圾滲濾液比例的方法,分離、

2、篩選出垃圾滲濾液中的10株耐鹽菌株。再經(jīng)實驗室搖瓶降解試驗,從中篩選出6株降解COD的優(yōu)勢菌株,并研究了溫度、接種量、pH對6株優(yōu)勢菌生長的影響。
　　 將不同優(yōu)勢菌株混合配比進行COD降解試驗,發(fā)現(xiàn)了以TJ06和TJ09菌株為混合配比的優(yōu)勢菌群具有較高的有機物去除效率。當COD濃度小于7375mg/L時,該優(yōu)勢菌群對滲濾液的COD去除效率隨著COD初始濃度的增加而增加。當COD濃度大于7375mg/L時,優(yōu)勢菌群對滲濾液的CO

3、D去除效率隨著COD初始濃度的增加而減少。
　　 菌株TJ06和TJ09具有良好的耐鹽特性。當培養(yǎng)基中Cl-濃度小于30000mg/L時,菌株TJ06和TJ09的相對生長率分別大于75％和60％。隨著培養(yǎng)基中Cl-濃度的增加,兩株菌的相對生長率均呈下降趨勢。當Cl-濃度為70000mg/L時,菌株TJ06培養(yǎng)24h,其相對生長率只有1.11％,48h時菌株TJ06和TJ09的相對生長率為40％左右;當Cl-濃度為90000mg/

4、L時,兩株菌的相對生長率均小于1％,幾乎不再生長。
　　 重金屬離子Zn2+、Cd2+對菌株TJ06和TJ09的生長具有明顯的抑制作用,這種抑制作用大小與培養(yǎng)基中Zn2+、Cd2+濃度呈正比。當培養(yǎng)基中Zn2+濃度為100mg/L時,菌株TJ06的相對生長率為40％左右;當Zn2+濃度大于100mg/L時,TJ06幾乎不再生長。菌株TJ09對Zn2+更敏感,當Zn2+濃度大于50mg/L時,TJ09的相對生長率低于10％。培養(yǎng)基

5、中Cd2+濃度為50mg/L時,菌株TJ06和TJ09的生長就明顯受到抑制,其相對生長率分別為40.59％和34.89％;當Cd2+濃度大于150mg/L時,TJ06和TJ09的相對生長率均小于10％。
　　 利用16S rDNA分析技術,對優(yōu)勢菌株進行序列分析。發(fā)現(xiàn)菌株TJ06與Bacillus cereus(EU931563)和Bacillus thuringiensis(AY138288)的同源性最高,達到99％。菌株TJ

6、09與Bacillus marisflavi(FJ554665)、Bacillus aquimaris(EU835730)和Bacillus baekryungensis(EU835731)的同源性達99％。并根據(jù)序列同源性分析建立相關菌種的系統(tǒng)進化樹,確認TJ06和TJ09均屬于Bacillus屬。
　　 為篩選優(yōu)勢菌株中COD降解相關基因,利用抑制消減雜交技術(SSH)對菌株TJ06和Bacillus cereus SA1.

7、196基因組進行比較,構(gòu)建一個庫容量為230個陽性克隆的消減雜交文庫。通過菌液PCR進行鑒定,擴增出差異片段205條。對12個差異片段進行核苷酸序列相似性比對和功能分析。結(jié)果顯示其中2個差異片段未檢索到同源序列,可能為新基因片段,其功能有待進一步研究:7個差異表達片段,雖然找到了與其相似性很高的序列,但功能未知;其他3個差異表達片段分別與肽甲硫氨酸亞砜還原酶的編碼基因同源性達90％、與編碼莽草酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因同源性達93％、與輔酶Q細胞