腺病毒介導的TK-GCV基因系統(tǒng)聯(lián)合腫瘤壞死因子-α治療膀胱癌細胞的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的： 膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，也是一個重要的公共衛(wèi)生問題，世界上每年診斷的膀胱癌超過二十萬例，每年約有一萬兩千人死于膀胱癌。在美國，為第4位最常見的惡性腫瘤，在我國，發(fā)病率位于泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的第一位。膀胱癌90％以上為移行上皮細胞癌(transitionalcellcarcinomaofthebladder，TCC)，對放療、化療敏感性不高，治療以手術為主，但是術后復發(fā)率較高，尤其是晚期腫瘤及有耐藥性的

2、原位膀胱癌，5年復發(fā)率約60％，15年復發(fā)率可達88％，其中10％-30％的復發(fā)腫瘤進展為浸潤型，遠期療效不佳。特別是表淺性膀胱癌經(jīng)尿道切除后的高復發(fā)率已經(jīng)成為了治療中亟待解決的問題。目前認為膀胱癌術后輔助治療是治療的關鍵，隨著自殺基因(suicidegene)系統(tǒng)對膀胱癌治療研究的逐步深入，大家逐漸認識到自殺基因系統(tǒng)是一種發(fā)展前景良好的治療方法，TK/GCV系統(tǒng)是目前應用最廣泛的自殺基因系統(tǒng)之一，TK/GCV通過表達胸苷激酶將無毒前藥

3、如丙氧鳥苷(ganciclovirGCV)磷酸化，作用于分裂期細胞，作為其底物摻入細胞DNA合成鏈并抑制細胞DNA聚合酶，使細胞DNA合成終止從而殺死細胞。國內(nèi)外不少學者利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或者腺病毒介導TK/GCV自殺基因系統(tǒng)進行各種腫瘤的治療研究，作用效果明顯。但是目前自殺基因系統(tǒng)存在著如基因轉(zhuǎn)染效率低下，基因轉(zhuǎn)導的靶向性差，各類載體及自殺基因本身對機體的毒性和損傷作用，載體及腫瘤細胞殺死后引發(fā)的自身免疫反應，前體藥物代謝產(chǎn)物僅僅針對分裂

4、期細胞等局限性。為了彌補自殺基因治療系統(tǒng)的不足，越來越多的學者都在研究將現(xiàn)有的治療方法和自殺基因治療系統(tǒng)相結(jié)合，以尋找對抗膀胱癌復發(fā)的新思路和新途徑。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種具有多種生物活性的細胞因子，尤其是對多種腫瘤細胞具有直接及間接的抑制和殺傷作用。在體外本身高濃度對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒作用具有直接殺傷作用外，較低濃度時它能夠通過誘導非增殖期細胞的凋亡而達到殺傷作用。在體內(nèi)通過免疫調(diào)節(jié)作用誘導產(chǎn)生其他細胞因子(IL-1，I

5、L-2，IFN-γ)增強免疫效應，并增強NK細胞、巨噬細胞的細胞毒性發(fā)揮抗腫瘤作用，同時能誘導腫瘤局部炎癥反應，引起血液凝固局部組織缺血壞死等機制引起腫瘤壞死。 TK/GCV基因系統(tǒng)聯(lián)合TNF-α治療膀胱癌的方法目前尚無相關報道。本實驗采用TK/GCV系統(tǒng)聯(lián)合小劑量TNF-α對鼠膀胱癌MB49細胞進行治療，并對其體外、體內(nèi)殺傷作用進行比較，探討二者聯(lián)合應用的治療效果，為自殺基因聯(lián)合細胞因子治療膀胱癌提供一定的實驗依據(jù)。

6、方法： 1、體外培養(yǎng)HEK293細胞及MB49細胞。 2、使用含TK基因和綠色熒光蛋白(greenfluorscentprotein，GFP)基因的復制缺陷腺病毒(AdCMV-TK，Adv+)轉(zhuǎn)染293細胞，擴增腺病毒。超速離心純化腺病毒，用綠色熒光蛋白表達細胞計數(shù)測定腺病毒滴度。 3、腺病毒感染膀胱癌MB49細胞，獲取轉(zhuǎn)染TK基因的MB49細胞。分別提取膀胱癌MB49細胞以及轉(zhuǎn)染TK基因MB49細胞RNA，進行

7、RT-PCR反應，電泳鑒定。 4、在體外培養(yǎng)的已轉(zhuǎn)染TK基因的MB49細胞的細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的GCV，GCV濃度為0、5、10、12.5、25、50、75、100、125μg/ml。在體外培養(yǎng)的MB49細胞的細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的TNF-α，TNF-α濃度為0、2.5、5、10、20、25、50、80、100μg/ml。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定藥物作用細胞72h后細胞存活率，確定GCV及TNF-α的有效作用

8、濃度。 5、根據(jù)以前的試驗結(jié)果及前述實驗所得GCV及TNF-α的有效作用濃度，選擇對MB49細胞殺傷作用較小的藥物濃度梯度(GCV取0、5、10、25、50μg/ml濃度，TNF-α取0、5、20μg/ml)分別加入GCV、GCV+TNF-α組作用已轉(zhuǎn)染腺病毒MB49細胞，以正常MB49細胞為空白對照。采用MTT法測定各治療組藥物作用轉(zhuǎn)染后膀胱癌細胞72h細胞殺傷率。流式細胞儀(FCM)檢測TK/GCV、TNF-α、TK/GCV

9、+TNF-α組作用8h后細胞凋亡情況。 6、雌性C57BL/6小鼠30只，皮下注射濃度為1×107/mlMB49細胞PBS懸液0.1ml，2周后選取腫瘤大小約100mm3鼠24只，隨機分成4組，每組6只，第1組為對照組：MB49(注射PBS)：第2組為TNF-α組：MB49/TNF-α；第3組為腺病毒加GCV治療組(TK/GCV)：MB49/(TK/GCV)；第4組為聯(lián)合治療組：MB49/(TK/GCV+TNF-α)。第3、4組

10、分別進行瘤體內(nèi)多點注射腺病毒，每次100μl，每天1次，連續(xù)3d，第1、2組僅在瘤體內(nèi)多點注射PBS每次100μl，每天1次，連續(xù)3d。從第4天開始，第2、4組在瘤體周圍皮下浸潤注射濃度為100μg/mlTNF-α100μl，第3、4組腹腔內(nèi)注射GCV100mg.kg-1第1組腹腔內(nèi)及瘤體周圍皮下分別注射PBS各在100μl，連續(xù)10d。之后再觀察2d結(jié)束實驗，測量各鼠腫瘤體積大小，并取出各組鼠腫瘤進行組織病理學檢查。 7、實驗

11、數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析(單向方差分析One-WayANOVA及析因分析)，以P≤0.05有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、293細胞能大量擴增腺病毒，純化后腺病毒滴度為2×109PFU/ml。 2、經(jīng)RT-PCR擴增己轉(zhuǎn)染腺病毒的MB49細胞出現(xiàn)大小為234bp的TK基因片段，而未轉(zhuǎn)染腺病毒的MB49細胞未擴增出相應片段，表明感染腺病毒的MB49細胞有TK基因mRNA表達。

12、 3、GCV作用72小時后轉(zhuǎn)染腺病毒MB49細胞存活率隨著GCV濃度的增高逐漸降低：GCV濃度為5μg/ml、25μg/ml、125μg/ml時細胞存活率分別平均為(96.97±1.67)％、(80.82±0.64)％、(28.15±1.61)％；TNF-α作用MB49細胞72小時后，細胞存活率隨著TNF-α濃度增高而逐漸降低，TNF-α濃度為2.5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml細胞存活率分別為(91.26±0.37)

13、％、(54.69±2.63)％、(14.69±1.51)％。GCV對轉(zhuǎn)染腺病毒MB49細胞及TNF-α對MB49細胞均有良好的抑制生長作用，且抑制作用的呈濃度依賴性。 4、低濃度TNF-α聯(lián)合時各個濃度GCV對細胞的殺傷率均較同濃度下單純GCV對細胞的殺傷率有明顯增強，且隨TNF-α濃度增高聯(lián)合治療組殺傷效率增強。聯(lián)合治療組較單獨應用TNF-α或GCV組統(tǒng)計學差異顯著(P=0.00)，作用轉(zhuǎn)染腺病毒MB49細胞72h后，單純50

14、μg/mlGCV組殺傷率僅為(24.39±1.10)％，而50μg/mlGCV+5μg/mlTNF-α組及50μg/mlGCV+20μg/mlTNF-α組殺傷率分別為(40.05±0.97)％、(65.47±0.67)％，說明低濃度TNF-α能明顯增強GCV對細胞的殺傷作用。流式細胞儀檢測TK/GCV、TNF-α、TK/GCV+TNF-α組細胞均出現(xiàn)典型的sub-G1期凋亡峰，聯(lián)合作用組凋亡率達(12.99±0.09)％較單獨用藥組(T

15、K/GCV組為(6.66±0.13)％、TNF-α組為(7.76±0.12)％)有明顯提高，統(tǒng)計學差異顯著(P=0.000)。說明TK/GCV、TNF-α均能有效誘導凋亡，且二者均有協(xié)同作用。 5、動物體內(nèi)實驗結(jié)束時對照組鼠腫瘤體積為171.52±4.33mm3，單用TK/GCV、TNF-α組的腫瘤體積分別為93.43±2.10mm3、53.95±2.61mm3，這兩組體積明顯小于對照組(P=0.000)。而聯(lián)合治療組腫瘤體積為

16、18.23±1.11mm3，明顯小于前面3組(P=0.000)。 6、組織病理學HE染色見各治療組均出現(xiàn)細胞壞死凋亡，聯(lián)合應用組較單獨應用自殺基因及細胞因子效果好，僅于周邊見少量活腫瘤細胞。 結(jié)論： 1、腺病毒載體能有效地將TK基因?qū)氚螂装㎝B49細胞中表達； 2、丙氧鳥苷(GCV)對轉(zhuǎn)染TK基因的鼠膀觥癌MB49細胞能有效地殺傷，有劑量依賴關系； 3、TNF-α在體外對鼠膀胱癌MB49細胞進有