K88菌毛細(xì)胞表面呈現(xiàn)載體的初步研究.pdf

1、腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起嬰幼兒和新生仔豬腹瀉的主要病原之一。其致病性決定于它在宿主小腸上皮細(xì)胞上的定居能力和產(chǎn)腸毒素的能力。ETEC定居宿主小腸上皮細(xì)胞的能力是由菌體表面的菌毛介導(dǎo)。細(xì)胞表面呈現(xiàn)技術(shù)是近來年在針對菌毛的疫苗研究中發(fā)展起來的一種新方法。將編碼菌毛的基因在非毒素源性大腸桿菌中表達(dá)并使菌毛在細(xì)胞表面組裝成菌毛,菌毛以完整形式在細(xì)胞表面出現(xiàn),而且菌毛抗原蛋白以多聚體的形式存在,將增強菌毛抗原的免疫原性。而且可在細(xì)胞表面獲

2、得含有外源抗原表位的雜合菌毛,即所謂的細(xì)胞表面呈現(xiàn),這是一種構(gòu)建多價活疫苗的理想途徑。 本實驗以Long and Accurate PCR技術(shù)擴增K88菌毛操縱子的結(jié)構(gòu)基因faeC-faeH并克隆到pBR322質(zhì)粒載體中,設(shè)計合成～段含ApaI和NcoI酶切位點的DNA序列,與SacI和BssHII酶切后的包含結(jié)構(gòu)基因faeC-faeH的質(zhì)粒連接；設(shè)計合成耐熱腸毒素STII表位編碼序列和口蹄疫病毒(FMDV)結(jié)構(gòu)蛋白VP1的20

3、1-200AA的線性表位編碼序列,與ApaI和NcoI酶切后的載體連接,構(gòu)建融合基因。用特異性引物PCR擴增fae操縱子的調(diào)控基因faeA和fseB及faeB上游的啟動子區(qū)域,并對所得序列進(jìn)行序列分析和生物信息學(xué)分析。PCR擴增STI-STII融合基因,選擇正向連接的克隆T-STI-STII,XhoI酶切后補平,與XhoI、SalI酶切后的T-LTB的小片段連接,構(gòu)建T-STI-STII-LTB質(zhì)粒；BamHI、SacI雙酶切T-STI

4、-STII-LTB后與pET28a連接,構(gòu)建原核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后表達(dá),SDS-PAGE確定最佳誘導(dǎo)時間和最佳IPTG濃度。 實驗PCR獲得了K88菌毛操縱子的結(jié)構(gòu)基因faeC-faeH并克隆到pBR322質(zhì)粒載體中得到重組質(zhì)粒pBR-fael,在pBR-fael中引入了ApaI和NcoI酶切位點得到了質(zhì)粒pBR-fae2;在pBR-fae2的ApaI和NcoI處融合STII表位和FMDV VP1表位,成

5、功構(gòu)建了pBR-fae-STII和pBR-fae-VP1質(zhì)粒?？寺×薴ae操縱子的負(fù)調(diào)控基因faeA。對K88ab、K88ac兩個血清型的faeA序列分析結(jié)果顯示,兩個血清型之間不存在差異：生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,faeA基因表達(dá)產(chǎn)物FaeA與其他大腸桿菌菌毛操縱子的負(fù)調(diào)控蛋白序列比較發(fā)現(xiàn),FaeA與其他FaeA樣負(fù)調(diào)控蛋白同時存在一個7個氨基酸的保守區(qū)。實驗還得到了正調(diào)控基因faeB及其啟動子區(qū)域和上游調(diào)控序列；對其序列分析后顯示,在

6、faeB基因上游的序列中包含啟動子的特征序列-35區(qū)和-10區(qū),同時存在與菌毛表達(dá)調(diào)控相關(guān)的三個GATC甲基化位點。將大腸桿菌耐熱性腸毒素ST和不耐熱性腸毒素LT的B亞單基因融合,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-STI-STII-LTB,轉(zhuǎn)化大腸桿BL21(DE3)后誘導(dǎo)表達(dá)。加入IPTG至終濃度為0.8mM誘導(dǎo),誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體蛋白行SDS-PAGE,電泳結(jié)果顯示融合基因得到高效表達(dá)并且當(dāng)誘導(dǎo)時間為4h時表達(dá)量達(dá)到最高。pBR-fae