糖基工程酵母表面呈現(xiàn)抗體庫的構(gòu)建和抗真菌β-甘露糖型抗體的篩選.pdf

1、近幾年來，抗體藥物是市場上生物藥物的主要品種之一，全球銷量最佳的生物藥物中抗體藥物占據(jù)很大比例。幾乎所有抗體藥物的表達(dá)系統(tǒng)都是基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，這是因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物與天然分子相近，例如翻譯后的糖基化修飾。但同時(shí)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)成本高、周期長，使其已嚴(yán)重阻礙了抗體藥物的發(fā)展。相比而言，畢赤酵母作為一種真核生物，具有繁殖速度快，產(chǎn)量高，培養(yǎng)成本低等優(yōu)勢，可以用于各種重組蛋白的表達(dá)和分泌。而經(jīng)過糖基工程改造之后的酵

2、母細(xì)胞，其蛋白質(zhì)的糖基化修飾接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)雜型糖型，而不再是一般酵母的高甘露糖型，與天然分子更加相似。糖基工程酵母的蛋白表達(dá)的糖基化修飾與真核細(xì)胞十分相似，且相比于哺乳動(dòng)物細(xì)胞成本更低，產(chǎn)量更高，糖基工程酵母有望成為包括抗體在內(nèi)的糖蛋白藥物的制備的新途徑。
　　抗體庫技術(shù)是目前發(fā)現(xiàn)特異性抗體的重要手段之一，基于該技術(shù)篩選抗體高效而快捷，能夠同時(shí)進(jìn)行不同抗原靶位的篩選，成為尋找、制備、研發(fā)新的單抗藥物的重要方式。從構(gòu)建方式上可

3、將抗體庫分為哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗體庫、噬菌體抗體庫和酵母抗體庫等。其中噬菌體抗體庫因其構(gòu)建方法簡單，庫容量大等優(yōu)點(diǎn)是目前所用最多的抗體庫，但噬菌體抗體庫表達(dá)多為單鏈抗體，現(xiàn)如今絕大多數(shù)通過抗體庫篩選得到的抗體，其結(jié)構(gòu)都不是抗體的天然構(gòu)象，多為單鏈抗體，因此需要在篩選之后重新進(jìn)行完整抗體的構(gòu)建和表達(dá)，步驟較為復(fù)雜。
　　本研究使用錨定蛋白Sed，構(gòu)建糖基工程酵母表面呈現(xiàn)抗體庫。使用Sed錨定蛋白在實(shí)現(xiàn)半抗體在酵母細(xì)胞表面展示的同時(shí)，還具備

4、分泌完整結(jié)構(gòu)單克隆抗體的能力，即與錨定蛋白串聯(lián)表達(dá)的Fc段，可以與分泌抗體的Fc結(jié)合通過二硫鍵聚合，將抗體結(jié)構(gòu)的一半即半抗體錨定在酵母細(xì)胞表面，錨定在細(xì)胞上的半抗體既可以保持最初的生物活性，也可以保持原有的結(jié)構(gòu)，不因定位在細(xì)胞表面而使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，利用這種雙重模式，在保留抗體完整結(jié)構(gòu)的情況下，達(dá)到篩選和表達(dá)分泌的統(tǒng)一。本研究利用糖基工程酵母構(gòu)建表面呈現(xiàn)免疫抗體庫，具體步驟如下：
　　抗禽流感血凝素（HA7）抗體質(zhì)粒庫的構(gòu)建：禽

5、流感血凝素HA7作為抗原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，在三次免疫之后提取小鼠脾臟細(xì)胞，對(duì)小鼠脾臟進(jìn)行研磨，提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒擴(kuò)增小鼠脾臟細(xì)胞的輕重鏈可變區(qū)基因，和人源IgG的恒定區(qū)基因同框融合構(gòu)建抗HA7的抗體質(zhì)粒庫，獲得約104的單克隆，隨機(jī)挑選10個(gè)單克隆測序，對(duì)比序列結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨機(jī)挑選的10個(gè)單克隆序列均具有抗體骨架結(jié)構(gòu)，同時(shí)可變區(qū)序列各不相同，說明質(zhì)粒庫的基因多態(tài)性良好。
　　糖基工程酵母表面呈現(xiàn)的免疫抗體庫的構(gòu)建：將錨定蛋白與抗

6、體Fc段（Fc-Sed）融合表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化糖基工程酵母細(xì)胞，陽性轉(zhuǎn)化克隆培養(yǎng)誘導(dǎo)后，用抗IgG-Fc抗體流式細(xì)胞檢測、篩選，獲得在糖基工程酵母表面錨定表達(dá)Fc-Sed融合蛋白的酵母細(xì)胞。將構(gòu)建好的質(zhì)粒庫電轉(zhuǎn)化表達(dá)了Fc-Sed融合蛋白的糖基工程酵母細(xì)胞，構(gòu)建表面抗體庫。
　　免疫磁珠法篩選抗體庫：因?yàn)槊庖叽胖楹Y選方法簡單、快捷，本研究采用免疫磁珠的篩選方式。先用空羧基磁珠通過縮合反應(yīng)將HA7蛋白結(jié)合在磁珠表面，之后將該磁珠加入到酵

7、母表面呈現(xiàn)抗體庫中進(jìn)行篩選。為了得到與HA7特異性結(jié)合的抗體，對(duì)抗體庫進(jìn)行兩輪篩選。將兩輪篩選菌液稀釋鋪板，分離單克隆。
　　ELISA方法檢測抗體與HA7蛋白結(jié)合能力：隨機(jī)挑選30個(gè)單克隆培養(yǎng)、誘導(dǎo)，培養(yǎng)上清采用ELISA雙抗夾心法鑒定抗體與HA7的結(jié)合能力。其中與HA7結(jié)合能力最強(qiáng)的抗體的稀釋倍數(shù)為1:200，而其他單克隆的表達(dá)上清最高為1:50，挑選滴度最高的單克隆搖瓶培養(yǎng)，proteinA純化后用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，將該抗體命

8、名為N2-2抗體。
　　N2-2抗體結(jié)合HA7蛋白的靶位分析：Western進(jìn)一步驗(yàn)證了N2-2抗體與HA7的結(jié)合情況，但N-糖肽酶PNGase F切除HA7的糖基后發(fā)現(xiàn)N2-2抗體不再與HA7蛋白結(jié)合，提示N2-2抗體的識(shí)別位點(diǎn)位于HA7的糖鏈。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，N2-2抗體與α-甘露糖基修飾的牛核糖核酸酶B，雜合型糖基修飾的昆蟲細(xì)胞表達(dá)的HA7，以及復(fù)雜型糖基修飾的雞胚來源的流感疫苗均不結(jié)合，而與酵母、白色念珠菌裂解物有明顯的結(jié)

9、合，提示其可能作用于真菌特有的糖基，如β-甘露糖，磷酸甘露糖等。Western分析發(fā)現(xiàn)，敲除β-甘露糖轉(zhuǎn)移酶ARM1的糖基工程酵母表達(dá)的HA7不與N2-2抗體結(jié)合，提示抗體可能結(jié)合在β-甘露糖上，再利用β-甘露糖苷酶切除HA7的末端甘露糖，Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶切之前66Kb的位置有條帶而酶切之后條帶消失，說明酶切之后的HA7蛋白不再與N2-2抗體有結(jié)合，最終確證N2-2抗體確實(shí)是與HA7糖鏈上的β-甘露糖結(jié)合。
　　N2-

10、2抗體在小鼠體內(nèi)的活性分析：β-甘露糖是真菌特有的糖型，因此，本研究以白色念珠菌為模型，研究N2-2的抗真菌活性。首先Western證實(shí)白色念珠菌裂解物可以與N2-2抗體結(jié)合，然后以BalB/C小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，首先將白色念珠菌的活菌用生理鹽水進(jìn)行稀釋，配置成濃度為1×107個(gè)/mL、4×107個(gè)/mL、1.6×108個(gè)/mL和6.4×108個(gè)/mL的菌液，將配置好的菌液通過腹腔注射。觀察小鼠的體重變化，確定感染后小鼠體重下降明顯的最佳

11、劑量是4×107個(gè)/mL。
　　將白色念珠菌的菌液配置成4×107個(gè)/mL，將BalB/C小鼠分成4個(gè)組，分別是生理鹽水組，白色念珠菌組，白色念珠菌+30μg N2-2抗體組和白色念珠菌+15μg N2-2抗體組，其中，兩抗體注射組抗體與白色念珠菌注射液預(yù)混合1h之后腹腔注射小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射了抗體的小鼠體重相比未注射抗體的小鼠，體重回升早，而且回升速度快；而不同劑量的N2-2抗體對(duì)小鼠體重的恢復(fù)也有影響，高劑量組的小鼠體重