組蛋白H3K27三甲基化抑制FGF4、HGF誘導(dǎo)BM-MSCs分化肝細(xì)胞及其分子機(jī)制.pdf

1、目的:了解H3K27me3在HGF、FGF4誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mBM-MSCs)定向分化肝細(xì)胞中的作用及其分子機(jī)制。方法:①全骨髓差異貼壁法分離培養(yǎng)獲得P3-P6代mBM-MSCs，添加HGF、FGF4培養(yǎng)7d后，Real time PCR檢測(cè)AFP、Foxa2、Jmjd3表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)H3K27m3、P-P38和P-AERK1/2表達(dá)水平，ChIP檢測(cè)AFP、Foxa2基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27m3和Jmj

2、d3結(jié)合水平，以未誘導(dǎo)0d組為對(duì)照。②將生長(zhǎng)旺盛BM-MSCs細(xì)胞隨機(jī)分五組:空白對(duì)照組、P38抑制劑組、ERK1/2抑制劑組、MSK1抑制劑組和細(xì)胞因子誘導(dǎo)組，Western blot檢測(cè)AFP、Foxa、P-P38、P-ERK1/2和P-MSK1表達(dá)水平，Real time PCR檢測(cè)AFP和Foxa2表達(dá)水平。③將三種Jmjd3慢病毒干擾載體以最佳MOI轉(zhuǎn)染mBM-MSCs，并設(shè)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，24h后檢測(cè)Jmjd3 mR

3、NA表達(dá)水平以驗(yàn)證其沉默效果;將生長(zhǎng)旺盛的P3-P5代BM-MSCs細(xì)胞隨機(jī)分四組:空白對(duì)照組、細(xì)胞因子誘導(dǎo)組、eGFP處理組和Jmjd3-shRNA1干擾組，培養(yǎng)24 h添加HGF、FGF4進(jìn)行培養(yǎng)，7d后檢測(cè)各組Jmjd3、AFP和Foxa2表達(dá)水平及AFP和Foxa2基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27m3和Jmjd3結(jié)合水平。結(jié)果:①誘導(dǎo)7d后，大部分BM-MSCs細(xì)胞形態(tài)與小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞相似; AFP、Foxa2和Jmjd3 mRNA和蛋白

4、的表達(dá)水平均明顯升高(p＜0.05)，而H3K27m3的蛋白表達(dá)明顯下降，同時(shí)檢測(cè)到7d時(shí)P-P38、P-ERK1/2的蛋白表達(dá)明顯升高;AFP、Foxa2啟動(dòng)子區(qū)上H3K27me3表達(dá)水平明顯下降，但其啟動(dòng)子區(qū)Jmjd3表達(dá)水平明顯上升（p＜0.05）。②與細(xì)胞因子誘導(dǎo)組相比，經(jīng)P38和ERK1/2通路抑制劑處理后，BM-MSCs細(xì)胞中的p-MSK1、AFP和Foxa2蛋白表達(dá)明顯下降;并證實(shí)經(jīng)MSK1通路抑制劑處理BM-MSCs中A

5、FP和Foxa2蛋白表達(dá);P38抑制劑組和MSK1抑制劑組均可極顯著下調(diào)AFP和Foxa2的mRNA表達(dá)水平（P＜0.01），ERK1/2抑制劑組可顯著下調(diào)AFP和Foxa2的mRNA表達(dá)（P＜0.05)。③與eGFP處理組相比，三個(gè)干擾組都能降低BM-MSCs細(xì)胞中的Jmjd3mRNA表達(dá)水平，抑制效率分別為81.3％51.7％和41.4％;且AFP、Foxa2和BRG1mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.01);Jmjd3-shRNA1干