FGF4、HGF通過(guò)MAPK通路啟動(dòng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的驗(yàn)證.pdf

1、目的：驗(yàn)證細(xì)胞因子FGF4、HGF啟動(dòng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mousebonemarrowmesenchymalstemcells，mBM-MSCs)向肝細(xì)胞分化是否通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 方法：①采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離6～8周小鼠骨髓來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞.采用反復(fù)貼壁篩選法純化，每3～4天更換新鮮培養(yǎng)液，選取形態(tài)均一、生長(zhǎng)良好的

2、克隆，用0.25％的胰酶-EDTA消化收集細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。②將培養(yǎng)至第3～7代mBM-MSCs分為五組添加誘導(dǎo)培養(yǎng)液：A．正常對(duì)照組；B．細(xì)胞因子誘導(dǎo)組；C．p38抑制劑組；D．ERK1/2抑制劑組；E．MSK1抑制劑組。③在p38抑制劑組、ERK1/2抑制劑組和MSK1抑制劑組中分別添加抑制劑SB203580、U0126及H89誘導(dǎo)液處理7天后收集各組細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timeFluorescenceQua

3、ntitativePCR，Real-timeFQ-PCR)和蛋白印跡(westernblot)檢測(cè)肝細(xì)胞分化早期特異性指標(biāo)甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)和肝細(xì)胞核因子-3β(hepatocytenuclearfactor-3β，HNF3β,alternativelycalledFOXα2)的變化，同時(shí)，westernblot檢測(cè)各組中磷酸化p38(phosphorylation-p38，p-p38)、磷酸化ERK1/2(

4、phosphorylation-ERK1/2，p-ERK1/2)和磷酸化MSK1(phosphorylation-MSK1，p-MSK1)的水平驗(yàn)證阻斷效果。
　　 結(jié)果：①正常對(duì)照組，mBMMSCs大部分（80％左右）貼壁伸展，呈纖維樣，小部分仍為小圓形，可見(jiàn)放射狀排列、形態(tài)均一的細(xì)胞集落；細(xì)胞因子誘導(dǎo)組，細(xì)胞開(kāi)始收縮，并逐步向多邊形轉(zhuǎn)化，細(xì)胞形態(tài)與正常分離培養(yǎng)的小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞相似，而與正常對(duì)照組未分化的BM-MSCs有明顯差

5、異；p38抑制劑組，細(xì)胞大小縮小、聚集成團(tuán)，且分化細(xì)胞形態(tài)改變的數(shù)量明顯減少；ERK1/2抑制劑組，細(xì)胞縮小成塊狀，分化細(xì)胞形態(tài)改變的數(shù)量有所減少；MSK1抑制劑組，細(xì)胞形態(tài)差異較大，狹長(zhǎng)且大部分呈現(xiàn)纖維樣或小圓形，分化細(xì)胞形態(tài)改變的數(shù)量明顯減少。②p38通路抑制劑SB203580和ERK1/2通路抑制劑U0126誘導(dǎo)液處理mBM-MSCs7天后，肝細(xì)胞早期表達(dá)基因AFP和HNF3β的表達(dá)量與細(xì)胞因子誘導(dǎo)組相比，均顯著降低(P＜0.05

6、)，且p38抑制劑組中其表達(dá)量降低更加明顯(P＜0.01)；另外，p38通路處理組與ERK1/2處理組相比，其表達(dá)量也有顯著性差異（P＜0.05）。蛋白激酶MSK1抑制劑H89誘導(dǎo)液處理7天后，肝細(xì)胞早期表達(dá)基因AFP和HNF3β的表達(dá)量與細(xì)胞因子誘導(dǎo)組相比，也顯著降低(P＜0.01)。③p38通路抑制劑SB203580和ERK1/2通路抑制劑U0126誘導(dǎo)液處理mBM-MSCs7天后，其p-p38和p-ERK1/2的水平與細(xì)胞因子誘導(dǎo)

7、組相比，均明顯降低；其早期指標(biāo)AFP和HNF3β的蛋白量與細(xì)胞因子誘導(dǎo)組相比，也顯著降低。④蛋白激酶MSK1抑制劑H89誘導(dǎo)液處理mBM-MSCs7天后，p-MSK1水平、蛋白AFP和HNF3β的表達(dá)量與細(xì)胞因子誘導(dǎo)組相比，均明顯減小。⑤p38通路抑制劑SB203580和ERK1/2通路抑制劑U0126誘導(dǎo)液處理mBM-MSCs7天后，通路p38和ERK1/2激活的蛋白激酶p-MSK1水平與細(xì)胞因子誘導(dǎo)組相比，表達(dá)量均明顯減少。