誘導(dǎo)干細(xì)胞心肌分化中甲基化修飾作用探討.pdf

1、目的：
　　在Islet-1誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2向心肌樣細(xì)胞定向分化過程中的早期相關(guān)基因啟動子區(qū)甲基化修飾作用探討。
　　方法：
　　1.實驗分組：①空白對照組（未經(jīng)處理的 C3H10T1/2細(xì)胞），②陰性對照組（感染慢病毒空載體的 C3H10T1/2細(xì)胞 Lv-GFP），③高表達(dá)Islet-1的C3H10T1/2細(xì)胞組，分為1周、2周、3周、4周四個時間點（Islet-1-1W、Islet-1-2W、I

2、slet-1-3W、Islet-1-4W），④在過表達(dá) Islet-1的C3H10T1/2中加入5-Aza的細(xì)胞組，為Islet-1+5-Aza組，⑤在過表達(dá)Islet-1的C3H10T1/2中加入BIX01294的細(xì)胞組，為Islet-1+ BIX01294組。
　　2.實驗方法：
　　熒光倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)與綠色熒光，流式細(xì)胞術(shù)（Flow CytoMetry，F(xiàn)CM）檢測轉(zhuǎn)染效率，用蛋白印跡法檢測Islet

3、-1蛋白表達(dá)，用實時熒光定量PCR檢測Mef2c、GATA4、Nkx2.5的mRNA的時序性表達(dá)，用免疫熒光檢測心肌特異蛋白cTnT、CX43的表達(dá)，用甲基化特異PCR檢測各組細(xì)胞的心肌特異早期基因CPG島的DNA甲基化水平，用染色質(zhì)免疫共沉淀檢測在 GATA4、Nkx2.5啟動子區(qū)結(jié)合的組蛋白甲基化水平。
　　結(jié)果：
　　1.熒光倒置顯微鏡顯示綠色熒光穩(wěn)定表達(dá)；流式細(xì)胞檢測Islet-1的轉(zhuǎn)染效率為91.7％；Wester

4、n blot顯示轉(zhuǎn)染Islet-1細(xì)胞組高表達(dá)Islet-1蛋白；與空白和陰性對照組相比，Islet-1組的細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出方向均一、短棒狀、排列緊密；免疫熒光結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 Islet-1細(xì)胞心肌特異性蛋白cTnT在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，心肌早期發(fā)育的特異性縫隙連接蛋白CX43在細(xì)胞膜上表達(dá)；Q-PCR檢測心肌特異早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4和Mef2c的表達(dá)逐漸增高，在第三周最明顯(*P<0.05)，第四周略有降低。
　　2.

5、MSP檢測 GATA4啟動子區(qū)的 CpG島的第二個位點（1329 bp-1489 bp) DNA甲基化水平，甲基化水平逐漸降低，在第三周最低（*P<0.05）；MSP檢測Nkx2.5啟動子區(qū)CpG島(51bp-219bp)的DNA甲基化水平，各組幾乎沒有變化；染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）結(jié)果顯示實驗組GATA4、Nkx2.5基因啟動子區(qū)組蛋白二甲基化水平依次降低，于第3周最低，且實驗組各組均低于空白組和陰性對照組（*P<0.05）。

6、r>　　3.CHIP檢測顯示Islet-1+5-Aza組的GATA4啟動子區(qū)組蛋白甲基化水平低于Lv-Islet-1組（*P<0.05）；MSP檢測顯示Islet-1+BIX01294組GATA4啟動子區(qū)DNA甲基化水平低于Lv-Islet-1組（*P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在誘導(dǎo)MSCs心肌分化中, GATA4啟動子區(qū)DNA甲基化與GATA4的表達(dá)負(fù)相關(guān)，而Nkx2.5可能不受DNA甲基化調(diào)控。
　　2.