IGFBP5在骨肉瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移作用機(jī)理的研究.pdf

1、目的：熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞株MG63，通過(guò)肺轉(zhuǎn)移灶原代培養(yǎng)的方法建立MG63細(xì)胞株轉(zhuǎn)移亞型細(xì)胞株MG63-1和MG63-2。 方法：體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株MG63細(xì)胞株，熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)膝關(guān)節(jié)注射腫瘤細(xì)胞建立腫瘤模型，5周左右，當(dāng)熒光成像儀掃描發(fā)現(xiàn)肺臟廣泛轉(zhuǎn)移時(shí)，取肺臟轉(zhuǎn)移腫瘤，原代培養(yǎng)得細(xì)胞株MG63-1，重復(fù)上述操作得細(xì)胞株MG63-2。 結(jié)果：（1）利用BSD篩選方法成功篩選到含熒光素酶的細(xì)胞株MG63-luc（

2、2）成功將篩選到的細(xì)胞株MG63-luc注射到4周齡裸鼠成瘤，并得到腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞型MG63-1和MG63-2。 結(jié)論：成功得到含有熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞株MG63-luc及其轉(zhuǎn)移亞型MG63-1和MG63-2，為進(jìn)一步研究骨肉瘤轉(zhuǎn)移打下了良好的基礎(chǔ)。 目的：通過(guò)一系列的腫瘤細(xì)胞經(jīng)典轉(zhuǎn)移能力方法，體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)比較MG63和MG63-2細(xì)胞株之間腫瘤轉(zhuǎn)移能力，證實(shí)MG62-2較MG63的轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)。 方法：繪制細(xì)胞生長(zhǎng)

3、曲線，劃痕實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞Matrigel遷移實(shí)驗(yàn)，與轉(zhuǎn)移相關(guān)的主要5個(gè)基因MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2和Ezrin的RT-PCR及western-blotting。 結(jié)果：（1）MG63-2的生長(zhǎng)較MG63生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞的周期長(zhǎng)。（2）MG63-2劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的融合較MG63慢，所需時(shí)間長(zhǎng)。（3）細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)證實(shí)MG63-2的細(xì)胞吸附能力較MG63強(qiáng)。（4）Matrigel遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)MG63-2的遷移能

4、力較MG63強(qiáng)。（5）RT-PCR以及western-blotting均證實(shí)MMP2和MMP9表達(dá)降低，TIMP2和Ezrin表達(dá)增高。 結(jié)論：通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，劃痕實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)、Matrigel遷移實(shí)驗(yàn)，與轉(zhuǎn)移相關(guān)的主要七個(gè)基因MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2和Ezrin的RT-PCR及其western-blotting，有差異表達(dá)，證實(shí)MG63-2較MG63在體外有著較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，為下一步研究打下堅(jiān)實(shí)之

5、基礎(chǔ)。 目的：本研究旨在通過(guò)膝關(guān)節(jié)注射動(dòng)物腫瘤模型觀察MG63和MG63-2之間腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移能力的區(qū)別。 方法：將MG63細(xì)胞和MG63-2細(xì)胞株的PBS細(xì)胞懸液注射入裸鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)。熒光素酶成像儀器觀察裸鼠原位腫瘤生長(zhǎng)情況和肺轉(zhuǎn)移情況。石蠟組織切片證實(shí)MG63-2在肺部有廣泛的轉(zhuǎn)移灶。 結(jié)果：（1）采用膝關(guān)節(jié)注射法成原位腫瘤法穩(wěn)定可靠；（2）原位腫瘤的生長(zhǎng)曲線證實(shí)MG63腫瘤組成瘤性較MG63-2生長(zhǎng)慢。（3）

6、熒光素酶成像儀觀察結(jié)果顯示MG63-2的成瘤性較強(qiáng)，且其肺臟內(nèi)轉(zhuǎn)移多而廣泛，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（4）組織學(xué)HE染色，光鏡下計(jì)數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)量，MG63-2有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。 結(jié)論：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)MG63-2較MG63細(xì)胞株有較強(qiáng)的細(xì)胞成瘤性和轉(zhuǎn)移能力。 目的：通過(guò)構(gòu)建IGFBP5基因高表達(dá)和IGFBP5 RNA干擾腺病毒，重點(diǎn)研究IGFBP5在腫瘤生長(zhǎng)其轉(zhuǎn)移的作用。 方法：構(gòu)建IGFBP5的腺病毒載體和IGFBP5

7、的干擾病毒，分別感染Mefs、C3H10和C2C12三類細(xì)胞株，觀測(cè)ALP讀數(shù)，分析研究IGFBP5對(duì)其分化的影響。病毒感染143B、MG63-P、MG63-1、MG63-2細(xì)胞株繪制生長(zhǎng)曲線，采用matrigel遷移實(shí)驗(yàn)分析IGFBP5對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株的遷移能力的影響。游標(biāo)卡尺及Xenogen image成像技術(shù)分析IGFBP5高表達(dá)和低表達(dá)后，腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移情況，分析其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的影響，石蠟組織切片，光鏡下看轉(zhuǎn)移灶的情

8、況，研究IGFBP5對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。 結(jié)果：（1）ALP讀數(shù)證實(shí)IGFBP5能促進(jìn)C3H10、mefs、C2C12的分化，但是抑制其增長(zhǎng)。而對(duì)SiIGFBP5則促進(jìn)增長(zhǎng)影響分化。（2）IGFBP5能抑制骨肉瘤143B-luc、MG63、MG63-1、Mg63-2的增長(zhǎng)，SiIGFBP5則促進(jìn)其增長(zhǎng)。（3）劃痕實(shí)驗(yàn)、matrigel腫瘤遷移實(shí)驗(yàn)，證實(shí)IGFBP5抑制腫瘤的遷移能力。（4）體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的測(cè)量及其成像均證實(shí)IGFBP