NGF及GAP-43在膀胱過度活動癥發(fā)病機制中的研究.pdf

1、前言：
　　 膀胱過度活動癥(OveractiveBladder,OAB)是一種常見病。ICS于2002年修訂OAB的定義是尿急,伴有或者不伴有急迫性尿失禁,常伴有尿頻和夜尿增多。由于OAB的機制目前不十分清楚,其在臨床的診斷治療不規(guī)范,治療效果并不十分理想,因此,探討OAB機制,尋找新的治療靶點是目前OAB研究的重點之一。
　　 神經(jīng)生長因子(NGF)的研究在1986年曾獲諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎,在維持許多器官自主神經(jīng)分布

2、中起重要作用。研究提示NGF和神經(jīng)分布有直接聯(lián)系。在新生動物,針對NGF的抗血清處理導(dǎo)致膀胱的神經(jīng)嚴重缺失。相反,注射NGF能增加大鼠膀胱神經(jīng)分布。人類NGF的基因定位于1號染色體上。在各種組織中,成熟的具有生物活性的NGF是由2條118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結(jié)合而成的二聚體。NGF的單體是一個延長的結(jié)構(gòu),單體一端有三個發(fā)夾舉;另一端有“半胱氨酸結(jié)”結(jié)構(gòu),具有穩(wěn)定分子的作用。
　　 生長相關(guān)蛋白(GAP-43)是一種細胞

3、內(nèi)的生長相關(guān)蛋白,在神經(jīng)生長與再生時時參與神經(jīng)通路起源與分支,對成熟細胞的突觸前膜的形成有作用,可導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、細胞內(nèi)吞、接合囊循環(huán)等。發(fā)育和再生過程中神經(jīng)元高水平表達并將之運輸至生長錐;而當(dāng)生長錐與靶器官一旦接觸,則其神經(jīng)元內(nèi)的含量迅速下降。根據(jù)GAP-43在軸突再生中的變化規(guī)律,可以認為,GAP-43強陽性神經(jīng)元表明其軸突處于再生過程中,由強陽性轉(zhuǎn)為弱陽性是再生神經(jīng)功能完善的表現(xiàn),而中等陽性當(dāng)為功能建立未完善的特征。
　

4、　 長期膀胱出口梗阻可引起膀胱一系列的形態(tài)及功能的改變,其中OAB是最常出現(xiàn)的變化,有的大鼠解除梗阻后,OAB癥狀仍要持續(xù),為了探討NGF及GAP-43在OAB發(fā)生機制中的作用,本課題擬從首先構(gòu)建OAB三種大鼠模型,使用尿流動力儀來確認大鼠成模,并比較三種模型優(yōu)缺點。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用免疫組化方法,Realtime-PCR及Westblot來檢測大鼠膀胱標(biāo)本中NGF及GAP-43含量,在組織、蛋白、基因三個層次,確定二者間關(guān)系。上述研究將

5、有助于提高對OAB發(fā)病機制的認識,為探索治療OAB的新的靶點提供了理論和實驗依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 實驗分為構(gòu)建OAB模型大鼠和檢測NGF及GAP-43兩部分,構(gòu)建OAB大鼠模型使用三種梗阻方法:恥骨上入路、經(jīng)閉孔恥骨后入路及會陰入路三種方法,以找到一種簡單高效的建立模型的方法。在此基礎(chǔ)上,利用成模大鼠檢測其膀胱中NGF及GAP-43的含量,并研究其在OAB發(fā)病中的可能機制。
　　 1、構(gòu)建OAB大鼠模

6、型部分
　　 (1)建立BOO大鼠,梗阻方法包括經(jīng)恥骨上膀胱頸梗阻、經(jīng)會陰尿道梗阻、和經(jīng)閉孔恥骨后中段尿道梗阻。
　　 (2)充盈期膀胱測壓檢查確定BOO大鼠6-8周后是否存在充盈期不穩(wěn)定收縮,按ICS的傳統(tǒng)標(biāo)準大于15cmH20的不穩(wěn)定收縮確定0AB大鼠。
　　 2、NGF及GAP-43檢測部分
　　 (1)病理標(biāo)本的制備及形態(tài)定量分析:取每只大鼠的膀胱組織,石蠟包埋切片,常規(guī)HE染色。對HE染色標(biāo)本進

7、行病理觀察。
　　 (2)NGF及GAP-43檢測:酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-1inkedimmunosorbentassay,ELISA),westenblot,realtime-PCR檢測各組大鼠膀胱組織。免疫組化染色:采用SABC(StreptActividin-BiotinComplex)法,對石蠟包埋標(biāo)本行NGF及GAP-43相對含量的測定。大鼠處死后,剖腹取膀胱組織50mg,液氮速凍,按RNA提取試劑盒操作說

8、明進行RNA的提取,擴增NGF及GAP-43序列,測定含量。
　　 結(jié)果：
　　 1、三種動物模型的構(gòu)建與確定:
　　 三種方式成模率:與經(jīng)會陰組及恥骨上組對照組比較,閉孔恥骨后組模型組大鼠成模率與恥骨上組相近(P＞0.05),此二組較會陰組明顯增高(P均＜0.05),但在副損傷方面優(yōu)于其它二組,說明此種方法更為先進。
　　 2、NGF及GAP-43檢測部分
　　 (1)NGF的表達水平
　

9、　 免疫組化,westenblot和real-timePCR結(jié)果顯示:與正常對照組比較,BOO組膀胱組織表達上升(p＜0.05)。與BOO組對比,BOO+OAB組NGFmRNA和蛋白表達顯著增高(p均＜0.05)。
　　 (2)GAP-43的表達水平
　　 免疫組化,westenblot和real-timePCR結(jié)果顯示:與正常對照組比較,BOO組膀胱組織表達上升(p＜0.05)。與BOO組對比,BOO+OAB組NGF