STAT3途徑參與乳腺癌髓系來源抑制細(xì)胞下調(diào)T細(xì)胞免疫及相關(guān)機(jī)制探討.pdf

1、目的:體外誘導(dǎo)MDSCs產(chǎn)生，建立iMDSCs模型，探究iMDSCs中STAT3下游信號(hào)通路的變化，闡明iMDSCs中STAT3調(diào)節(jié)IDO表達(dá)的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:收集30例健康供者外周血，分離CD33+細(xì)胞，通過與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231共孵育體外誘導(dǎo)iMDSCs。iMDSCs與T細(xì)胞共育檢測iMDSCs對T細(xì)胞增殖和分泌的影響。ELISA檢測iMDSCs培養(yǎng)上清中因子的變化。采用Western blotting方法

2、檢測STAT3下游信號(hào)C/EBPβ、NF-κB和非經(jīng)典NF-κB表達(dá)情況。用siRNA敲低C/EBPβ和NF-κB后，檢測IDO的表達(dá)變化。生物素探針檢測IDO啟動(dòng)子區(qū)潛在信號(hào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，ChIP檢測信號(hào)蛋白在IDO啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合情況。因子芯片檢測iMDSCs分泌上清中多種細(xì)胞因子水平變化情況，通過在誘導(dǎo)iMDSCs中加刺激因子和中和抗體后檢測其IDO表達(dá)變化。建立BALB/c小鼠4T1乳腺癌模型，驗(yàn)證阻斷STAT3信號(hào)通路對腫瘤在體內(nèi)

3、生長和轉(zhuǎn)移的影響，以及IDO表達(dá)情況。
　　結(jié)果:iMDSCs與T細(xì)胞共育能抑制T細(xì)胞的增殖，加用IDO特異性抑制劑1-MT或STAT3抑制劑JSI-124后T細(xì)胞增殖能力明顯升高(P＜0.05)，而1-MT組和JSI-124組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ELISA試劑盒檢測MDSCs處理T細(xì)胞上清，顯示MDSC顯著抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ，促進(jìn)TGF-β、IL-10釋放(P＜0.05)。而加用1-MT或JSI-124后，IFN-γ釋放水平

4、升高、TGF-β、IL-10釋放水平降低，與MDSCs處理組對比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示JSI-124和1-MT一樣可以逆轉(zhuǎn)MDSCs對Th1類細(xì)胞因子分泌的抑制作用。為進(jìn)一步探究STAT3對于IDO的調(diào)控機(jī)制，通過生物信息學(xué)軟件在IDO啟動(dòng)子區(qū)檢測STAT3潛在的結(jié)合位點(diǎn)，在啟動(dòng)子上游發(fā)現(xiàn)有STAT3結(jié)合位點(diǎn)，然而ChIP實(shí)驗(yàn)顯示STAT3未直接結(jié)合到IDO啟動(dòng)子區(qū)。Western Blotting檢測STAT3下游信號(hào)C/

5、EBPβ、NF-κB和非經(jīng)典NF-κB，發(fā)現(xiàn)它們在iMDSCs中被激活。加用STAT3特異性抑制劑JSI-124后，C/EBPβ、NF-κB和非經(jīng)典NF-κB信號(hào)蛋白明顯減少。siRNA敲低C/EBPβ，IDO的表達(dá)未見明顯減少;而用siRNA敲低非經(jīng)典NF-κB后，IDO的表達(dá)明顯減少。核ELISA檢測非經(jīng)典NF-κB途徑下游信號(hào)蛋白p52和RelB在iMDSCs核內(nèi)表達(dá)明顯增加，提示非經(jīng)典NF-κB途徑參與STAT3介導(dǎo)的IDO表達(dá)

6、。生物信息學(xué)軟件在IDO啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)有p52-RelB潛在的結(jié)合位點(diǎn)，生物素探針檢測在IDO啟動(dòng)子區(qū)上游1000bp～2000bp有p52-RelB高親和特異性位點(diǎn)。ChIP實(shí)驗(yàn)證明p52-RelB直接結(jié)合IDO啟動(dòng)子區(qū)引起IDO表達(dá)，提示STAT3通過激活非經(jīng)典NF-κB途徑，引起下游信號(hào)p52-RelB轉(zhuǎn)位到核，直接結(jié)合IDO啟動(dòng)子區(qū)引起IDO表達(dá)。因子芯片檢測MDSCs培養(yǎng)上清中因子變化情況，MDA-MB-231和臍血CD33+細(xì)

7、胞培養(yǎng)上清中的因子水平之和作為對照組，比較對照組和iMDSCs組以及iMDSCs組和JSI-124處理組之間的因子改變。結(jié)果顯示GRO-α、IL-6、GM-CSF、GRO、IL-1β、IL-10和MCP-3在iMDSCs中較對照組明顯升高;IL-10、MCP-3、GRO-α、GRO、PDGF-BB、IL-1β、IL-3、MCP-1、GM-CSF和IL-6在JSI-124處理組明顯降低。通過ELISA檢測進(jìn)一步驗(yàn)證IL-6，GM-CSF，

8、IL-10和IL-1β在上清中變化情況，并檢測經(jīng)典的IDO激活劑IFN-γ和TGF-β的變化。對照組與iMDSCs組相比較發(fā)現(xiàn)IL-6，GM-CSF，IL-10和IL-1β的分泌差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，分別為IL-6由296.90±47.72ng/ml增加到3684.34±381.08ng/ml， GM-CSF由412.50±51.70ng/ml升高到6001.16±502.89ng/ml，IL-10由271.170±97.4

9、5ng/ml升高到2495.55±324.78ng/ml，IL-1β由97.27±19.65ng/ml升高到2736.15±495.31ng/ml。而在加用JSI-124組中，IL-6減少到952.38±446.19ng/ml，GM-CSF減少到1129.61±145.18ng/ml，IL-10減少到215.96±141.85ng/ml。IFN-γ和TGF-β未見明顯改變（P＞0.05）。在iMDSCs培養(yǎng)上清中加入IL-6，GM-CS

10、F，IL-10和IL-1β刺激因子，發(fā)現(xiàn)加IL-6因子后IDO表達(dá)明顯升高，而IL-6中和抗體可明顯減弱IDO表達(dá)，提示IL-6參與STAT3調(diào)控IDO表達(dá)的過程。建立BALB/c小鼠4T1乳腺癌模型，觀測到JSI-124治療能降低乳腺癌荷瘤鼠模型腫瘤負(fù)荷;髓系來源的CD11b+細(xì)胞STAT3通路被抑制，伴有NIK和IDO表達(dá)的減少。提示體內(nèi)STAT3-非經(jīng)典NF-κB-IDO在體內(nèi)MDSCs中存在，通過阻斷STAT3活化可以抑制小鼠乳