口服Ag85A DNA疫苗誘導腸道IEL亞群及其生物學活性的變化.pdf

1、目的:今年年初世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2009年全球結核病控制報告》中指出，目前全球結核菌感染人數超過20億，其中結核病患者或可能發(fā)病者約占1/10。我國約有5.5億人已經感染結核桿菌，現(xiàn)有活動性肺結核患者約450萬。全世界耐多藥/廣泛耐藥結核病例數約為50萬，我國是其中總數排名前五位的高負擔國家之一。目前卡介苗(BCG)作為唯一臨床使用的疫苗，預防效果并不穩(wěn)定。因此研制新疫苗成為當前結核病防治的首要任務。
　　 BCG作為一種減毒

2、活疫苗，除用于預防結核病外，也作為一種強的非特異性細胞免疫刺激劑，用于腫瘤(如膀胱癌等)的治療。研究還證明BCG與動物和人等一些腫瘤細胞間存在著共同抗原。但BCG灌注治療膀胱癌的毒副作用也常使部分患者因不能耐受其副作用而不得不終止BCG灌注治療。
　　 Ag85復合物是由A、B、C三種成分組成，存在于結核桿菌和BCG等分枝桿菌的細胞壁及培養(yǎng)濾液中。在BCG Ag85的三種成分中Ag85A所占的比例最大，而且多項研究表明Ag85A

3、抗原是一種十分重要的免疫保護性抗原。近年來的研究表明，Ag85A可使小鼠脾CD8+CTL的細胞毒活性增強，可刺激機體Th1型細胞因子，如IL-2、IFN-γ、TNF-α等的產生水平升高；促進NK細胞、單核-巨噬細胞等對腫瘤細胞的殺傷作用。但由于結核分枝桿菌生長緩慢，并且需要較復雜生長條件，從細菌菌體中提取Ag85A蛋白易發(fā)生凝集和降解，更難于純化。同時Ag85A作為一種異種蛋白質長期使用仍有可能發(fā)生變態(tài)反應等不良反應。1996年Huyg

4、en等[23]首次報道用結核分支桿菌Ag85A編碼基因的質粒DNA經肌肉接種途徑免疫小鼠，可誘導小鼠產生很強的細胞和體液免疫應答，抵御結核分支桿菌的攻擊。
　　 自90年代初首次報道應用DNA疫苗進行免疫以來，大量的研究已經顯示了DNA疫苗的實際效果和廣闊的應用前景。近些年來已將DNA疫苗的應用研究擴展到了抗感染、抗腫瘤、治療變態(tài)反應性疾病和自身免疫病及降低組織器官移植排斥反應等多個領域。DNA疫苗可經多種途徑(如粘膜、皮膚和肌

5、肉等)和采用多種方式(如口服、噴霧和注射等)接種，依據所含目的基因及表達產物的不同可致機體產生免疫應答上調或下調及免疫應答的類型不周。經口服進行DNA疫苗接種是一種簡便、易于被人們接受的方式。但口服DNA疫苗在黏膜局部的表達情況和誘導局部的免疫細胞，特別是IEL的變化，目前尚不清楚。為此，我們采用經口灌飼的方式給小鼠投與自制的Ag85A DNA疫苗，在觀察腸道局部細胞表達的基礎上，對其誘導的IEL亞群及生物學功能的變化進行了研究，目的是

6、探討經口服途徑接種分枝桿菌Ag85A DNA疫苗有否預防和治療效應。
　　 材料與方法
　　 1、重組質粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A的構建
　　 采用PCR技術擴增Ag85A基因片段，與真核表達pcDNA3.1/myc-hisA質粒載體連接成重組質粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A，再轉化至大腸桿菌DH5α，于-70℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、Ag85A DNA疫苗的制備

7、r>　　 采用V-gene無內毒素型超純質粒DNA制備試劑盒分離純化pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質粒。采用電穿孔轉化法將pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質粒轉化到減毒傷寒沙門氏菌ST7207菌苗，經大量培養(yǎng)細菌制成由減毒傷寒菌苗攜帶的Ag85ADNA疫苗。
　　 同時將純化的pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質粒用脂質LipofectamineTM2000包裹，制成脂質體

8、包裹的Ag85A DNA疫苗。
　　 3、動物分組與免疫
　　 檢測Ag85A DNA疫苗誘導小鼠腸IEL亞群的變化：將C57BL/6小鼠隨機分成3組，即重組質粒組、空質粒組和正常對照組。每只鼠免疫3次，前二次免疫間隔10天，后二次免疫間隔14天。重組質粒組前二次經口灌飼脂質體包裹Ag85ADNA疫苗，后一次經口灌飼減毒傷寒菌-Ag85ADNA疫苗。同樣方法分別給后二組小鼠口灌飼減毒傷寒菌-pcDNA3.1菌和生理鹽水作

9、為對照。末次免疫后3周檢測IEL亞群。
　　 檢測Ag85ADNA疫苗誘導小鼠腸IEL的生物學功能變化：將C57BL/6小鼠隨機分成3組，即重組質粒組、空質粒組和正常對照組。每只鼠免疫2次，間隔2周。重組質粒組經口灌飼減毒傷寒桿菌-Ag85A DNA疫苗菌液；空質粒組和正常對照組以同樣方法分別經口灌飼減毒傷寒桿菌-V1Jns.tPA菌和生理鹽水。末次免疫后的第1、3、6、9和12d處死小鼠進行IEL生物學功能檢測。
　　

10、 4、IEL的分離
　　 去小鼠全部小腸，翻轉，截成數段，清洗干凈；加消化液于37℃恒溫振蕩；靜置片刻后，去含游離細胞的上層液通過紗布及玻璃棉柱，再用淋巴細胞分層液分離。
　　 5、IEL細胞亞群的檢測
　　 采用流式細胞分析儀分析測定T細胞亞群。
　　 6、IEL的培養(yǎng)
　　 將IEL調成所需細胞濃度，加終濃度為5μg/ml Ag85A蛋白孵育48小時，離心收集培養(yǎng)上清液，用于細胞因子的測定。<

11、br>　　 7、細胞因子的檢測
　　 采用生物活性測定法(依賴細胞株檢測法)檢測IEL培養(yǎng)上清中的IL-2；采用雙抗體夾心ELISA法檢測IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β。
　　 8、FasL分子表達的檢測
　　 提取IEL總RNA，采用半定量RT-PCR技術檢測FasL mRNA的表達。FasLmRNA的表達水平用所測定的擴增產物FasL的電泳條帶密度與β-actin電泳條帶密度的比值表示。

12、>　　 9、細胞毒活性檢測
　　 采用放射核素釋51Cr釋放法。將IEL先用絲裂霉素處理的轉染Ag85A cDNA的p815細胞刺激，然后與靶細胞(51Cr標記的P815細胞)共孵育一定時間，用γ計數儀測定培養(yǎng)上清中的放射活性cpm值。計算細胞毒活性。計算公式：細胞毒活性(％)=(IEL孔釋放cpm值-自然釋放孔cpm值/最大釋放孔cpm值-自然釋放孔cpm值)x100％
　　 10、細胞增殖活性檢測
　　 采

13、用放射性核素[3H]thymidine攝入法檢測IEL的增殖活性。將IEL用終濃度為5μg/mlAg85A蛋白刺激培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入[3H]thymidine，將培養(yǎng)的細胞收集細胞至玻璃纖維濾膜上，將玻璃纖維濾膜放入液體閃爍液內，用β液體閃爍計數儀測定cpm值。計算刺激指數公式：刺激指數=實驗孔cpm值-空白對照孔cpm值/空白對照孔cpm值。
　　 11、腸組織SIgA水平測定
　　 采用SIgA放免分析試劑盒測定腸

14、組織SIgA水平。剪取小腸中段約5cm，縱行剖開，洗凈剪碎，每克腸組織加入10ml生理鹽水，制成勻漿，離心取上清液。然后按說明書進行測定。
　　 結論:
　　 1、轉化pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A和pcDNA3.1/myc-hisA減毒傷寒沙門氏菌成功。
　　 2、經口接種Ag85A DNA疫苗誘導了CD3+CD8αβ+IEL、CD3+CD8αα+IEL、CD3+TCRγδ+IEL和CD103+

15、IEL的比例升高，CD25+IEL和Foxp3+IEL比例降低，CD3+IEL和CD3+TCRαβ+IEL的數量未見明顯變化，提示經口途徑投與Ag85ADNA疫苗可能主要誘導CD8+CTL介導的細胞免疫應答，而不是誘導免疫耐受。
　　 3、經口接種Ag85A DNA疫苗可誘導IEL的細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10和TGF-β分泌水平增加；IL-4水平無變化；特異性細胞毒活性增強；FasL表達增加；IEL特異性增殖活性增