口服Ag85A DNA疫苗對小鼠腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞毒活性的影響.pdf

1、在完成國家自然基金資助項(xiàng)目《腸上皮淋巴細(xì)胞在消化道潰瘍中生物活性的變化》和遼寧省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目《Ag85A基因疫苗治療膀胱癌的研究》的基礎(chǔ)上，已經(jīng)建立了與iIEL研究相關(guān)的一整套實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如iIEL及其亞群的分離技術(shù)，細(xì)胞因子檢測技術(shù)，細(xì)胞毒及NK活性檢測技術(shù)等。本實(shí)驗(yàn)為國家自然科學(xué)基金《自制口服DNA疫苗的黏膜表達(dá)部位與誘導(dǎo)腸iIEL效應(yīng)機(jī)制的研究》中的一部分，擬采用構(gòu)建的可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Ag85A基因的質(zhì)粒，制成可供口服的DNA

2、疫苗，經(jīng)口服途徑投與小鼠，以觀察DNA疫苗對IEL的生物學(xué)活性的影響為重點(diǎn)，進(jìn)行口服DNA疫苗的黏膜局部免疫應(yīng)答效應(yīng)的研究，闡明口服DNA疫苗誘導(dǎo)腸道局部黏膜免疫反應(yīng)的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)將對口服DNA疫苗誘導(dǎo)腸道IEL的功能變化及黏膜局部免疫應(yīng)答效應(yīng)有較深入的了解，為調(diào)節(jié)腸道局部免疫功能提供新思路，并且將為口服DNA疫苗的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料和方法: 按照Pure Yield Plasmid Maxip

3、rep System質(zhì)粒抽提試劑盒的說明從大腸桿菌中提取AgS5A質(zhì)粒，然后用Bgl Ⅱ限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定Ag85ADNA的存在。C57BL/6小鼠30只，雄性，6-8周齡，體重18-22克，隨機(jī)分成3組:①生理鹽水組10只，經(jīng)口灌飼10μl生理鹽水；②空質(zhì)粒組10只，經(jīng)口灌飼10μl1g/L以1∶1-1∶0.5的比例在室溫狀態(tài)下與脂質(zhì)體乳化融合的空質(zhì)粒；③Ag85A疫苗組10只，經(jīng)口灌飼100μl 1g/L A

4、g85A疫苗，共免疫三次，每次間隔14天，于末次免疫后的第10天頸脫位法處死各組小鼠，收集iIEL和脾細(xì)胞。用PE-cy5-CD3，F(xiàn)ITC-CD4和PE-CD8熒光抗體標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析。同時(shí)用乳酸脫氫酶法測定脾NK細(xì)胞毒活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。 結(jié)論: 1、口服Ag85ADNA疫苗后小鼠CD4<'->CD8<'+>iIEL百分比明顯降低，CD4<'+>CD8<'->iI