Ag85A口服DNA疫苗的制備及其誘導(dǎo)T細(xì)胞亞群應(yīng)答效應(yīng)的研究.pdf

1、本文通過構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌Ag85A與真核表達(dá)載體：pCDNA3.1<'+>的重組DNA疫苗，并檢測其可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Ag85A蛋白，以陽離子脂質(zhì)體為運載體，制成可供口服的DNA疫苗，經(jīng)口途徑投與小鼠，檢測疫苗的體內(nèi)體外免疫生物活性及其誘導(dǎo)T細(xì)胞亞群應(yīng)答效應(yīng)。 實驗材料： 一、主要儀器： 流式細(xì)胞儀，二氧化碳孵箱，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，離心機(jī)，低溫冰箱，超速離心機(jī)，超濾器，超凈工作臺等。 二、主要試劑：

2、 減毒鼠傷寒沙門菌X4064，RPMI1640培養(yǎng)基，pUCm-T載體，真核表達(dá)載體pCDNA3.1<'+>，DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，鼠anti-TB Ag85A，柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，膠回收試劑盒，T4 DNA連接酶，小牛血清，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，免疫組化ABC試劑盒，Western-blot相關(guān)試劑，結(jié)核分支桿菌H37Rv株，引物，PCR擴(kuò)增試劑盒，IPTG、X-gal培養(yǎng)基，SDS-PAGE電泳相關(guān)試

3、劑，Xho Ⅰ及BamH Ⅰ，細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒等。 三、實驗動物： C57BL/6小鼠30只，6-8周齡，SPF級，購自中科院上海實驗動物中心。 實驗方法： 一、真核表達(dá)編碼Ag85A基因重組體的構(gòu)建。 1、引物設(shè)計根據(jù)GenBank中Ag85A基因序列，PCR所用引物：上游引物5’ -CAGGATCCGCGCGCGCAGTCTGACCTAGTTGAGGATGC-3’，含BamHI酶切

4、位點：下游引物5’-GTCTCGAGAGGGCCGCCGCCGTTAATCGCT-3’含Xho Ⅰ酶切位點，并在ORF終止密碼子之后。Ag85A含信號肽序列。確保克隆基因開放讀碼框正確。 2、結(jié)核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8周，小量抽提DNA為模板，按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。 3、PCR技術(shù)擴(kuò)增Ag85A基因94℃預(yù)變性15min，熱啟動后轉(zhuǎn)入94℃變性imin，60℃退火1.5min，72℃延伸

5、2min，進(jìn)行30個循環(huán)，72℃延伸10min后終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后取5ul產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后采用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。 4、純化PCR產(chǎn)物TA克隆入載體pUCm-T載體按pUCm-T載體PCR擴(kuò)增試劑盒建立反應(yīng)體系：lOxbuffer 1ul，pUCm-T載體1ul，PCR產(chǎn)物3ul，T4 DNA連接酶1ul，加ddH<,2>O至10ul，25℃連接30min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，

6、取100ul轉(zhuǎn)化后的菌液鋪于含氨芐青霉素(60ug/ml)、工PTG 4ul(200mg/ml)、X-gal 40ul(20mg/ml)的LB瓊脂平板，平放30min后，37℃倒置培養(yǎng)過夜(12-16小時)。 5、藍(lán)白斑篩選待藍(lán)色充分顯現(xiàn)，挑取白色菌落于含有氨芐青霉素(60ug/ml)的LB培養(yǎng)基，37℃200 RPM振搖培養(yǎng)過夜，并擴(kuò)增Amp抗性克隆，質(zhì)粒提取試劑盒小量抽提質(zhì)粒。 二、穩(wěn)定高效表達(dá)Ag85A基因細(xì)胞系的

7、建立。 1、無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒pCDNA3.1<'+>/Ag85A的提取按照Promega和V-gerle公司無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書分別進(jìn)行大量和中量重組質(zhì)粒制備。 2、脂質(zhì)體介導(dǎo)的K562細(xì)胞的轉(zhuǎn)染驗證重組質(zhì)粒中目的基因的瞬時表達(dá)2ul脂質(zhì)體與2ug重組質(zhì)粒在不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中共孵育15min后轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，37℃、5％CO<,2>孵育24h后，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)4

8、8h。 3、重組質(zhì)粒pCDNA3.1<'+>/Ag85A在K562細(xì)胞中表達(dá)的Ag85A蛋白鑒定在G418(400ug/ml)的細(xì)胞培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長的K562細(xì)胞生長密度達(dá)1×l0<'7>/ml時，PBS洗滌、離心收集細(xì)胞，運用細(xì)菌蛋白提取試劑盒裂解細(xì)胞。以12％分離膠，5％濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色，拍照分析。 三、口服Ag85A DNA疫苗的體內(nèi)表達(dá)和對T細(xì)胞亞群的影響。 1

9、、大量抽提無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒pCDNA3.1<'+>/Ag85A，包裹陽離子脂質(zhì)體，制備成可供口服的DNA疫苗。 2、C57 BL/6小鼠30只，雄性，隨機(jī)分為5組，每組6只，NS-生理鹽水組：JO-空質(zhì)粒組：L+JO-脂質(zhì)體+空質(zhì)粒組組：JA-重組DNA組：L+JA-脂質(zhì)體包裹的重組質(zhì)粒組，共免疫3次，每次間隔2周，末次免疫后7天收集各組免疫小鼠的血清及脾細(xì)胞。JA和JO組小鼠分別經(jīng)口灌飼100μg重組質(zhì)粒pCDNA3.1<'+

10、>/Ag85A和100μg pCDNA3.1<'+>質(zhì)粒載體。 實驗結(jié)果 1、真核表達(dá)編碼Ag85A基因重組體的構(gòu)建重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切證實成功構(gòu)建了攜帶Ag85A基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1<'+>/Ag85A，后者成功轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。經(jīng)測序分析所克隆1141bp Ag85A與GenBank中結(jié)核分枝桿菌Ag85A氨基酸同源性為100％。 2、脂質(zhì)體最佳使用濃度驗證重組質(zhì)粒pCDNA3

11、.1<'+>/Ag85A DNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞時與脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM>2000的最適比例為2ug∶2ul，此時脂質(zhì)體能夠成功介導(dǎo)轉(zhuǎn)染且對細(xì)胞毒性較小。 3.Ag85A蛋白的表達(dá)Western-blot及SDS-PAGE檢測轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞株存在分子量為32KD的Ag85A蛋白的表達(dá)，與成熟的Ag85A蛋白分子量一致，表明Ag85A基因在K562細(xì)胞中得到了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有免疫反應(yīng)性。以此作為構(gòu)建口服脂

12、質(zhì)體疫苗的依據(jù)。 4、G418篩選穩(wěn)定表達(dá)Ag85A蛋白的細(xì)胞株G418篩選48h后的轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株，800ug/／ml濃度殺死未轉(zhuǎn)染的正在分裂的細(xì)胞，400ug/ml為殺死未轉(zhuǎn)染的正在分裂的細(xì)胞的最低濃度，以此濃度為選擇壓力，防止質(zhì)粒丟失。經(jīng)過12周篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)Ag85A蛋白的細(xì)胞株，以FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗，熒光顯微鏡下可觀察到大量黃綠色熒光，而對照組未見特異性熒光，大部分熒光染色細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞膜；

13、經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析表達(dá)Ag85A蛋白的細(xì)胞所占比例為41.73％。 5、口服免疫對小鼠脾細(xì)胞T細(xì)胞亞群的影響脂質(zhì)體對T細(xì)胞無毒性，CD4<'+>T細(xì)胞及CD8<'+>T細(xì)胞的百分率均出現(xiàn)下調(diào)，其中空質(zhì)粒組無顯著作用，無脂質(zhì)體包裹的重組質(zhì)粒組對CD4<'+>、 CD8<'+>T細(xì)胞有降低作用，但脂質(zhì)體+重組質(zhì)粒組對CD4<'+>、 CD8<'+>T細(xì)胞降低作用效果更明顯。 6、口服DNA疫苗后小鼠脾淋巴細(xì)胞的Th1型細(xì)胞因子

14、IFN γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4分泌水平的檢測結(jié)果分泌IFN-y的Th1型細(xì)胞比率和血清中的IFN-γ水平下降，而分泌IL-4的Th2型細(xì)胞比率和血清中的IL-4水平升高。 7、血清中Ag85A特異性抗體產(chǎn)生水平的檢測結(jié)果用間接ELISA方法檢測血清中Ag85A特異性抗體的產(chǎn)生，血清中抗體滴度脂質(zhì)體包裹的重組DNA組所產(chǎn)生的特異性抗體水平最高，抗體滴度為1∶160：重組DNA組為1∶80，而脂質(zhì)體包裹的空質(zhì)粒組和空質(zhì)粒組無特

15、異性抗體產(chǎn)生。說明該口服疫苗可誘導(dǎo)一定的體液免疫。 8、脂質(zhì)體包裹的重組質(zhì)粒組血清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生水平受到抑制。 9、血清中Th2型細(xì)胞因子IL-4的產(chǎn)生水平脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒組相對較高，而其它各組無顯著差異。 研究結(jié)論： 1、經(jīng)DNA序列測定證實插入片段的序列與與GenBank中結(jié)核分枝桿菌Ag85A核苷酸編碼的氨基酸同源性為100％，pCDNA3.1<'+>/Ag85A重組質(zhì)粒構(gòu)建成

16、功。 2、重組質(zhì)粒pCDNA3.1<'+>/Ag85A DNA經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞表達(dá)的Ag85A蛋白具有免疫原性。 3、成功轉(zhuǎn)染并獲得穩(wěn)定表達(dá)Ag85A蛋白的K562細(xì)胞株，此細(xì)胞可用于Ag85A蛋白的大量制備及其它方面的研究。 4、口服自制Ag85A DNA疫苗可在體內(nèi)表達(dá)并刺激抗Ag85A特異性抗體的產(chǎn)生。 5、口服自制Ag85A DNA疫苗下調(diào)了脾CD4<'+>T細(xì)胞和CD8<'+>T細(xì)胞亞群的數(shù)

17、量。 6、分泌IFN-r的Th1型細(xì)胞比率和血清中的IFN-r水平下降，而分泌IL-4的Th2型細(xì)胞比率和血清中的IL-4水平升高。提示脾CD4<'+>T細(xì)胞數(shù)量下降可能主要為Thl型細(xì)胞數(shù)量的下降，而Th2型細(xì)胞數(shù)量下降不明顯或沒有下降。 7、L+JA組IFN-r的分泌水平顯著低于L+JO組，提示載體質(zhì)粒pCDNA3.1<'+>中所含的CpG基序可能具有刺激T細(xì)胞分泌IFN-r作用，而重組質(zhì)粒pCDNA3.1<'+>/