生長因子聯(lián)合組織工程對骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞促增殖作用的分子影像研究.pdf

1、研究背景:
　　近年來，以干細(xì)胞為代表的再生醫(yī)學(xué)為多種終末期疾病的臨床再生治療帶來了新的希望。在心血管病、神經(jīng)損傷修復(fù)、肝臟衰竭等多種危害人類健康的重大疾病的治療領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景。其中自體骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)由于取材方便、體外擴增能力強、無免疫原性、不涉及倫理道德、基因轉(zhuǎn)染效率高等特點受到更多的關(guān)注，并獲得可喜成績。然而，作為“細(xì)胞藥物”的干細(xì)胞在單獨移植到體內(nèi)受損部位后，均會不同程度地發(fā)生急性死亡和偏離目

2、標(biāo)區(qū)域，極大影響B(tài)MSCs潛在的治療效果。
　　多種生物調(diào)節(jié)因子可以通過協(xié)調(diào)和引導(dǎo)各類細(xì)胞信號，促進干細(xì)胞的增殖和定向分化，其中主要包括堿性成纖維生長因子（bFGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、血管生長因子（VEGF）等；此外，以基質(zhì)膠（Matrigel）構(gòu)建的三維骨架為載體，利用組織工程學(xué)方法進一步改善細(xì)胞生長的微環(huán)境，據(jù)報道可有利于移植細(xì)胞的存活和分化。但是，各種生長因子與基質(zhì)膠的聯(lián)合應(yīng)用是否對BMSCs產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)

3、，目前仍然缺乏直接有力的研究依據(jù)。
　　干細(xì)胞在體存活的示蹤技術(shù)中，生物發(fā)光成像技術(shù)具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性，它主要利用熒光素酶和底物結(jié)合的高特異性，將活細(xì)胞獨有的化學(xué)能轉(zhuǎn)變成為可見光能，通過光子強度與標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目的正比關(guān)系，監(jiān)測干細(xì)胞體內(nèi)外的增殖和存活情況。具有其他技術(shù)不可比擬的高靈敏度、高時間分辨率。
　　研究目的:
　　1.通過觀察不同生長因子（VEGF、bFGF、IGF-1）對BMSCs增殖和凋亡的影響，闡明生

4、長因子及Akt信號通路對BMSCs增殖和凋亡的作用；
　　2.通過報告基因成像技術(shù)活體動態(tài)長程觀察不同生長因子（VEGF、bFGF、IGF-1）聯(lián)合基質(zhì)膠對BMSCs移植后體內(nèi)存活增殖的作用,并初步探討其機制。
　　實驗方法:
　　第一部分：BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及生長因子對其在體外的增殖影響
　　1.分離培養(yǎng)-actin-lucFVB轉(zhuǎn)基因小鼠來源的BMSCs，并采用貼壁篩選法進一步純化，通過細(xì)胞表面標(biāo)志

5、物（APC-CD90(+)、PE-CD44(+)、PE-CD34(-)和PE-CD45(-)）進行細(xì)胞流式分析鑒定；
　　2.培養(yǎng)至第3代的BMSCs，分別加入VEGF、bFGF、IGF-1(20ng/ml，72h)；利用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色實驗檢測各組BMSCs的增殖能力；TUNEL法染色實驗檢測各組BMSCs的體外凋亡情況；Western-blot方法檢測各組BMSCs中Akt及pAkt蛋白表達水平。
　　第二部

6、分：生長因子聯(lián)合Matrigel對BMSCs在體的增殖影響
　　1.BMSCs分離培養(yǎng)鑒定方法同第一部分；
　　2.利用IVIS小動物活體成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞數(shù)量與光學(xué)信號強度的關(guān)系，確定移植細(xì)胞數(shù)量
　　3.將既定移植細(xì)胞數(shù)量與20μl基質(zhì)膠、20ng生長因子混合后，種植在-Actin-lucFVB轉(zhuǎn)基因小鼠的近交系小鼠背部皮下；利用小動物活體成像系統(tǒng)觀察移植后既定時間點各組信號表達情況；
　　4.取第3周細(xì)胞移植

7、組織標(biāo)本，TUNEL法檢測移植組織細(xì)胞凋亡情況；Western-blot方法檢測移植組織Akt及p-Akt蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分：BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及生長因子對其在體外的增殖影響
　　1.通過細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定確定所培養(yǎng)細(xì)胞為BMSCs；
　　2.MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，bFGF（0.1051±0.01512％vs0.0671±0.01745％，P<0.05）；IGF-1（0.1

8、0436±0.01252％vs0.0671±0.01745％，P<0.05）均可明顯促進BMSCs增殖；
　　3.TUNEL結(jié)果顯示，與對照組相比，bFGF（44.0±2.0％vs56.0±3.7％，P<0.05）、IGF-1（36.3±3.2％vs56.0±3.7％，P<0.05）可以抑制BMSCs凋亡；
　　4.Western-blot結(jié)果顯示，對照組相比，B+bFGF組（0.47±0.0306vs0.28
　　±

9、0.0378，p<0.05）、B+IGF-1組（0.57±0.0200vs0.28±0.0378，p<0.05）的pAkt蛋白表達水平明顯增高。
　　第二部分：生長因子聯(lián)合Matrigel對BMSCs在體的增殖影響
　　1.通過IVIS成像系統(tǒng)檢測，定量分析到Fluc的光學(xué)信號強度與細(xì)胞數(shù)量呈線性相關(guān)；
　　2.IVIS成像結(jié)果顯示，移植后第5周（B+M+I）組細(xì)胞存活率明顯高于其他實驗組（B+M+I：21％，其他組均

10、<10％）（p<0.05）；
　　3.TUNEL結(jié)果顯示，與對照組相比，B+M+b組(32.00±1.63％vs42.33±2.05％，P<0.05)，B+M+I組（26.66±1.69％vs42.33±2.05％，P<0.05）凋亡率明顯降低；
　　4.Western-blot結(jié)果顯示，與對照組相比，B+M+b組(0.49±0.032vs0.33±0.0153，p<0.05)和B+M+I組（0.63±0.025vs0.33