血管內皮細胞生長因子165基因轉染人骨髓間充質干細胞構建組織工程皮膚的實驗研究.pdf

1、嚴重創(chuàng)傷、大面積燒傷、腫瘤摘除、整形術后的創(chuàng)面覆蓋一直是困擾臨床醫(yī)生的難題。目前常規(guī)的治療方法有自體、異體或異種皮移植。自體皮膚來源極為有限，而且存在著形成新創(chuàng)面的缺陷；異體或異種皮膚移植解決了自體皮源不足的問題，但由于難以克服的免疫排斥反應，目前只能用作暫時封閉創(chuàng)面的覆蓋物。近年來，組織工程皮膚的構建與應用為皮膚缺損的修復提供了極具發(fā)展?jié)摿Φ闹委熗緩?。但現(xiàn)階段各種組織工程化皮膚移植存活率明顯低于自體斷層皮片，其首要原因之一是組織工程化

2、皮膚移植后缺乏足夠的血管化而導致低灌注和缺血損傷。因此，如何促進移植皮膚的血管化，成為組織工程皮膚臨床推廣應用研究的關鍵。 研究表明，利用轉基因技術，將血管生成調控因子基因導入目的細胞，使其表達某些調控因子，可有效促進血管生成。 骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，在不同的誘導條件下可向骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、肌細胞和內皮細胞等各種細

3、胞系轉化，由于骨髓間充質干細胞屬未分化的前體干細胞，表型分化尚不成熟，免疫原性小，所以移植后無排斥反應或反應較弱，而且，骨髓間充質干細胞還具有取材方便、體外擴增容易、體外增殖能力強、易于基因操作等獨特的優(yōu)點，逐漸成為基因治療適宜的細胞載體。血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知的最強的促血管再生因子，近年來應用血管內皮細胞生長因子165基因（VEGF165）轉染骨

4、髓間充質干細胞，用于心肌缺血或肢體缺血性疾病的實驗及臨床研究已取得了令人矚目的成就，但將其應用于組織工程皮膚構建的研究尚未見報道，因此，采用基因轉移技術將hVEGF165基因轉入骨髓間充質干細胞中，使其有效表達目的基因和蛋白，構建活性組織工程皮膚，植入皮膚創(chuàng)面后使骨髓間充質干細胞在局部短期內分泌VEGF蛋白，從而促進組織工程皮膚的早期血管化，有可能為解決組織工程皮膚血管化這一問題提供新的方法與思路。 本研究采用脂質體介導hVEG

5、F165基因轉染人骨髓間充質干細胞，觀察VEGF165基因mRNA轉錄、蛋白的表達情況及轉染后對骨髓間充質干細胞的影響，并接種轉染VEGF165基因的骨髓間充質干細胞于同種異體脫細胞真皮支架上構建VEGF基因修飾的活性皮膚替代物，移植修復動物全層皮膚缺損創(chuàng)面，觀察其在皮膚結構和功能重建中的作用及其轉歸，比較缺損創(chuàng)面移植皮膚的血管化情況，為加速組織工程皮膚移植后血管化、提高其臨床移植成功率探索新的途徑。 基于這種認識，我們開展了以

6、下一系列研究： 第一部分人骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：建立一種分離純化和培養(yǎng)入骨髓間充質干細胞的方法，為利用骨髓間充質干細胞進行基因治療提供實驗基礎。 方法密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結合，分離純化人骨髓間充質干細胞。倒置相差顯微鏡下觀察人骨髓間充質干細胞形態(tài)學變化；流式細胞儀檢測人骨髓間充質干細胞的表面標記以及細胞周期；繪制人骨髓間充質干細胞的生長曲線；透射電鏡觀察人骨髓間充質干細胞的超微結構。

7、 結果：密度梯度離心結合貼壁法能分離培養(yǎng)出純度較高的人骨髓間充質干細胞。流式細胞儀檢測人骨髓間充質干細胞CD90、CD29、CD44、CD34、CD45陽性表達細胞比率分別為98.48％、98.74％、97.41％、0.36％、0.64％。人骨髓間充質干細胞的生長曲線呈S形。透射電鏡示細胞核漿比大，可見部分細胞器和蛋白分泌物。 結論：采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結合，可獲得純度較高和活性骨髓MSC，是簡便有效實用可行的方法。

8、 第二部分血管內皮細胞生長因子165基因轉染人骨髓間充質干細胞的實驗研究 目的：觀察人骨髓間充質干細胞轉染VEGF165基因后外源性基因及其蛋白的表達，探討其促進組織工程皮膚移植后血管化的可能性。 方法：體外分離、培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞，采用脂質體介導方法將pShuttle-CMV/VEGF165質粒轉染人骨髓間充質干細胞，并設立空質粒對照組（轉染pShuttle-CMV載體）、脂質體對照組（轉脂質體）和正常對照組

9、（無特殊處理），用RT-PCR、ELISA和Western Blot檢測入骨髓間充質干細胞VEGF165 mRNA及其蛋白的表達情況，MTT法及流式細胞儀檢測VEGF質粒轉染對骨髓間充質干細胞活性的影響。 結果：RT-PCR檢測結果顯示：質粒轉染實驗組、空質粒對照組、脂質體對照組和正常對照組VEGF165基因mRNA表達量分別為0.89±0.03、0.34±0.04、0.40±0.03、0.30±0.03。質粒轉染實驗組骨髓間充

10、質干細胞mRNA轉錄較三個對照組均顯著上調（P<0.01）。ELISA檢測質粒轉染實驗組、空質粒對照組、脂質體對照組和正常對照組處理后24h細胞上清hVEGF的濃度分別為778.39±35.21pg/ml、543.55±24.32pg/ml、561.45±28.08pg/ml、571.53±22.73pg/ml，質粒轉染實驗組與其他對照組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。質粒轉染后第7天表達達到最高，以后再逐漸降低。Western B

11、lot檢測結果顯示轉染組條帶明顯增強（P<0.01）。MTT法及凋亡檢測結果顯示VEGF質粒轉染對骨髓間充質干細胞增殖無影響。 結論：實現(xiàn)了VEGF165基因對人骨髓間充質干細胞的成功轉染，并有效表達目的基因及其蛋白，具有促進組織工程皮膚移植后血管化的應用前景。 第三部分血管內皮細胞生長因子165修飾骨髓間充質干細胞復合脫細胞真皮基質構建活性組織工程皮膚 目的：以VEGF修飾的骨髓間充質干細胞復合脫細胞真皮基質構

12、建活性組織工程皮膚，為進一步臨床應用奠定基礎。 方法：體外培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞，以脂質體介導pShuttle-CMV/VEGF165質粒轉染骨髓間充質干細胞后，將其接種于制備好的脫細胞真皮支架上，構建組織工程皮膚，觀察細胞生長情況及其與支架材料的相容性。 結果：脫細胞真皮基質去細胞完全，組織相容性好，轉基因骨髓間充質干細胞在脫細胞真皮基質中生長良好，可體外構建組織工程皮膚。 結論：利用VEGF修飾骨髓間充質干細

13、胞及制備的脫細胞真皮基質可以體外聯(lián)合構建活性組織工程皮膚。 第四部分含基因骨髓間充質干細胞的活性皮膚移植促進組織工程皮膚血管化的初步研究 目的：探討含基因骨髓間充質干細胞的活性皮膚移植促進組織工程皮膚血管化的基因治療的可行性。 方法：新西蘭白兔26只，于兔背部兩側常規(guī)全層皮膚缺損創(chuàng)面4個，隨機分為四組：A組（以含VEGF基因骨髓間充質干細胞復合脫細胞真皮構建的組織工程皮膚修復創(chuàng)面，hVEGF165-MSCs+AD

14、M實驗組），B組（以骨髓間充質干細胞復合脫細胞真皮構建的組織工程皮膚修復創(chuàng)面，MSCs+ADM對照組），C組（以不含細胞的脫細胞真皮修復創(chuàng)面，單純ADM對照組）和D組（創(chuàng)面不做處理），觀察局部組織微血管密度變化及創(chuàng)面愈合情況。 結果：移植術后一周，hVEGF165-MSCs+ADM實驗組創(chuàng)面的毛細血管密度較MSCs+ADM對照組、單純ADM對照組明顯增高（P<0.01），兩周時三組中hVEGF165-MSCs+ADM實驗組的血管