丙型肝炎病毒核心蛋白抑制Wnt信號通路拮抗因子SFRP1的分子機(jī)制.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是人類最常見的致死性惡性腫瘤之一，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染是引發(fā)HCC的重要危險因素。全球已有約2億人感染HCV，約占世界總?cè)丝诘?％，每年新增病例300萬～400萬。目前HCV抗病毒治療主要采用聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林，但這種治療手段對高滴度HCV RNA和血清型為HCVⅠ型的患者效果并不理想。HCV感染嚴(yán)重危害人們的身

2、體健康，因此深入研究HCV感染相關(guān)HCC的致病機(jī)理將為防治HCV感染疾病提供新的防治策略。核心蛋白是HCV病毒編碼產(chǎn)生的分子量為21 kDa的多功能結(jié)構(gòu)蛋白。研究表明:核心蛋白參與丙型肝炎病毒的組裝、釋放，并與細(xì)胞內(nèi)重要的一些轉(zhuǎn)錄因子或者多種信號通路相互作用，削弱機(jī)體的免疫防御功能，進(jìn)而引起HCV相關(guān)肝硬化甚至肝癌的發(fā)生;HCV核心蛋白還能與p53、p73、pRb等抑癌基因直接結(jié)合，抑制細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　Wnt/β

3、-catenin信號通路的異常激活在肝癌的發(fā)生中至關(guān)重要，目前研究表明它的異常激活至少與50％以上的HCC發(fā)生相關(guān)。HCC臨床標(biāo)本中，AXIN基因突變比較少見，由β-catenin基因突變引起β-catenin的活化僅占20％，結(jié)腸腺瘤樣息肉基因(AdenomatousPolyposis Coli，APC)的失活突變?nèi)晕丛贖CC中發(fā)現(xiàn)，這表明在HCC發(fā)生過程中，Wnt/β-catenin信號通路的拮抗分子如SFRPs的失活可能參與了該信

4、號通路的異?；罨?br>　　DNA甲基化修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要方式，研究證實，肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等眾多實體腫瘤中均存在SFRPs啟動子區(qū)高度甲基化修飾。已有研究表明病毒感染機(jī)體后能夠以表觀遺傳修飾的方式調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，引起細(xì)胞的異常分化、增殖，導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。HCV核心蛋白能否通過甲基化、乙?；?、或組蛋白修飾等表觀遺傳水平調(diào)控SFRPs基因的表達(dá)，目前還未見研究報道。本課題組前期實驗已經(jīng)證實HCV核心

5、蛋白能夠下調(diào)SFRP1的表達(dá)，本研究旨在進(jìn)一步深入探討核心蛋白調(diào)控SFRP1的分子機(jī)制;并從正反兩方面驗證表觀遺傳對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法:本課題組前期實驗已經(jīng)證實丙型肝炎病毒核心蛋白能夠下調(diào)SFRP1的表達(dá)，并且SFRP1的表達(dá)經(jīng)DAC處理后能夠部分恢復(fù)。本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用基因重組技術(shù)構(gòu)建SFRP1啟動子區(qū)截短報告質(zhì)粒，確定啟動子區(qū)活性最強(qiáng)區(qū)域，并探討HCV核心蛋白對SFRP1啟動子活性的影響;通

6、過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)研究核心蛋白對SFRP1基因表觀沉默的分子作用機(jī)制。此外，通過平板克隆形成實驗、結(jié)晶紫染色、腫瘤細(xì)胞遷移實驗、侵襲實驗和肝癌裸鼠移植瘤模型系統(tǒng)研究HCV核心蛋白對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。進(jìn)一步采用亞重硫酸鹽DNA測序方法驗證核心蛋白是否可以促進(jìn)裸鼠移植瘤細(xì)胞中SFRP1啟動子區(qū)高甲基化修飾，用免疫組化方法檢測裸鼠移植瘤中PCNA、β-cateni

7、n及Wnt下游靶基因c-Myc以及MMP2、MMP9的表達(dá)。
　　結(jié)果:本實驗利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了SFRP1啟動子區(qū)截短報告質(zhì)粒，通過雙熒光素酶活性檢測方法確定SFRP1啟動子區(qū)活性最強(qiáng)區(qū)域為-407～-27nt，并且證實HCV核心蛋白能夠抑制SFRP1啟動子區(qū)的活性。ChIP結(jié)果顯示:在過表達(dá)核心蛋白的Huh7及SK-Hep1細(xì)胞中，核心蛋白可增強(qiáng)Dnmt1、HDAC1及甲基化結(jié)合蛋白MBD1，MBD2，MeCP2富集于S

8、FRP1的啟動子區(qū)，抑制乙?；M蛋白H3、組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶P300結(jié)合于SFRP1啟動子區(qū)。平板克隆形成實驗和結(jié)晶紫實驗均證實，在穩(wěn)定表達(dá)HCV核心蛋白的肝癌細(xì)胞系中，核心蛋白促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，沉默Dnmt1和（或）回復(fù)SFRP1能夠抑制這種作用。遷移以及侵襲實驗表明，HCV核心蛋白增強(qiáng)肝癌細(xì)胞系Huh7及SK-Hep1細(xì)胞遷移及侵襲能力，同樣，沉默Dnmt1和（或）回復(fù)表達(dá)SFRP1能夠抑制這種作用。體內(nèi)實驗研究表明沉默Dnmt1和

9、（或）回復(fù)表達(dá)SFRP1能夠抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，下調(diào)β-catenin和Wnt下游靶基因的表達(dá)。同時也證明，沉默Dnmt1和（或）回復(fù)SFRP1能夠抑制MMP2、MMP9的表達(dá)。
　　結(jié)論:HCV核心蛋白可通過增強(qiáng)Dnmt1，HDAC1及甲基化相關(guān)蛋白MBD1、MBD2、MeCP2富集于SFRP1啟動子區(qū)，誘導(dǎo)其甲基化，抑制其啟動子區(qū)活性，導(dǎo)致SFRP1基因表達(dá)沉默。體外及體內(nèi)實驗證實HCV核心蛋白通過下調(diào)Wnt/β-cat