丙型肝炎病毒核心蛋白抑制Wnt信號通路拮抗因子SFRP1的分子機制.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是人類最常見的致死性惡性腫瘤之一，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染是引發(fā)HCC的重要危險因素。全球已有約2億人感染HCV，約占世界總人口的3％，每年新增病例300萬～400萬。目前HCV抗病毒治療主要采用聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林，但這種治療手段對高滴度HCV RNA和血清型為HCVⅠ型的患者效果并不理想。HCV感染嚴重危害人們的身

2、體健康，因此深入研究HCV感染相關HCC的致病機理將為防治HCV感染疾病提供新的防治策略。核心蛋白是HCV病毒編碼產生的分子量為21 kDa的多功能結構蛋白。研究表明:核心蛋白參與丙型肝炎病毒的組裝、釋放，并與細胞內重要的一些轉錄因子或者多種信號通路相互作用，削弱機體的免疫防御功能，進而引起HCV相關肝硬化甚至肝癌的發(fā)生;HCV核心蛋白還能與p53、p73、pRb等抑癌基因直接結合，抑制細胞的凋亡，導致腫瘤的發(fā)生。
　　Wnt/β

3、-catenin信號通路的異常激活在肝癌的發(fā)生中至關重要，目前研究表明它的異常激活至少與50％以上的HCC發(fā)生相關。HCC臨床標本中，AXIN基因突變比較少見，由β-catenin基因突變引起β-catenin的活化僅占20％，結腸腺瘤樣息肉基因(AdenomatousPolyposis Coli，APC)的失活突變仍未在HCC中發(fā)現(xiàn)，這表明在HCC發(fā)生過程中，Wnt/β-catenin信號通路的拮抗分子如SFRPs的失活可能參與了該信

4、號通路的異?；罨?。
　　DNA甲基化修飾是表觀遺傳調控的重要方式，研究證實，肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、肝癌等眾多實體腫瘤中均存在SFRPs啟動子區(qū)高度甲基化修飾。已有研究表明病毒感染機體后能夠以表觀遺傳修飾的方式調控基因的轉錄和表達，引起細胞的異常分化、增殖，導致相關疾病的發(fā)生。HCV核心蛋白能否通過甲基化、乙酰化、或組蛋白修飾等表觀遺傳水平調控SFRPs基因的表達，目前還未見研究報道。本課題組前期實驗已經證實HCV核心

5、蛋白能夠下調SFRP1的表達，本研究旨在進一步深入探討核心蛋白調控SFRP1的分子機制;并從正反兩方面驗證表觀遺傳對腫瘤細胞生物學行為的影響。
　　方法:本課題組前期實驗已經證實丙型肝炎病毒核心蛋白能夠下調SFRP1的表達，并且SFRP1的表達經DAC處理后能夠部分恢復。本實驗在前期實驗的基礎上，進一步采用基因重組技術構建SFRP1啟動子區(qū)截短報告質粒，確定啟動子區(qū)活性最強區(qū)域，并探討HCV核心蛋白對SFRP1啟動子活性的影響;通

6、過染色質免疫共沉淀技術(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)研究核心蛋白對SFRP1基因表觀沉默的分子作用機制。此外，通過平板克隆形成實驗、結晶紫染色、腫瘤細胞遷移實驗、侵襲實驗和肝癌裸鼠移植瘤模型系統(tǒng)研究HCV核心蛋白對細胞生物學行為的影響。進一步采用亞重硫酸鹽DNA測序方法驗證核心蛋白是否可以促進裸鼠移植瘤細胞中SFRP1啟動子區(qū)高甲基化修飾，用免疫組化方法檢測裸鼠移植瘤中PCNA、β-cateni

7、n及Wnt下游靶基因c-Myc以及MMP2、MMP9的表達。
　　結果:本實驗利用基因重組技術成功構建了SFRP1啟動子區(qū)截短報告質粒，通過雙熒光素酶活性檢測方法確定SFRP1啟動子區(qū)活性最強區(qū)域為-407～-27nt，并且證實HCV核心蛋白能夠抑制SFRP1啟動子區(qū)的活性。ChIP結果顯示:在過表達核心蛋白的Huh7及SK-Hep1細胞中，核心蛋白可增強Dnmt1、HDAC1及甲基化結合蛋白MBD1，MBD2，MeCP2富集于S

8、FRP1的啟動子區(qū)，抑制乙?；M蛋白H3、組蛋白乙?；D移酶P300結合于SFRP1啟動子區(qū)。平板克隆形成實驗和結晶紫實驗均證實，在穩(wěn)定表達HCV核心蛋白的肝癌細胞系中，核心蛋白促進肝癌細胞增殖，沉默Dnmt1和（或）回復SFRP1能夠抑制這種作用。遷移以及侵襲實驗表明，HCV核心蛋白增強肝癌細胞系Huh7及SK-Hep1細胞遷移及侵襲能力，同樣，沉默Dnmt1和（或）回復表達SFRP1能夠抑制這種作用。體內實驗研究表明沉默Dnmt1和

9、（或）回復表達SFRP1能夠抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，下調β-catenin和Wnt下游靶基因的表達。同時也證明，沉默Dnmt1和（或）回復SFRP1能夠抑制MMP2、MMP9的表達。
　　結論:HCV核心蛋白可通過增強Dnmt1，HDAC1及甲基化相關蛋白MBD1、MBD2、MeCP2富集于SFRP1啟動子區(qū)，誘導其甲基化，抑制其啟動子區(qū)活性，導致SFRP1基因表達沉默。體外及體內實驗證實HCV核心蛋白通過下調Wnt/β-cat