NKG2B、NKG2D的基因克隆及其對NK細胞系YT生物學功能的影響.pdf

1、目的:NK細胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應細胞，具有廣泛的生物學功能，位于機體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線；不需要預先刺激即可識別并殺傷腫瘤和病毒感染的細胞，同時又能通過早期分泌多種細胞因子(如IFγ、GM-CSF和TNF-β)和趨化因子來調(diào)節(jié)獲得性免疫應答，因此，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。NK細胞及其分泌的細胞因子不僅參與調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫，而且參與調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)的功能，在血液系統(tǒng)疾病，尤其是異基因骨髓移植中，在抑制和預防G

2、VHD，促進GVT效應和促進血液和免疫系統(tǒng)重建方面起重要作用。 同時，NK細胞對自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)亦引起了人們的重視。因此，盡管關(guān)于NK細胞的發(fā)育分化和識別功能的研究遠遠滯后于T細胞和B細胞，近年來，關(guān)于NK細胞功能和調(diào)節(jié)的研究引起了人們極大的興趣，并有了突飛猛進的發(fā)展，成為免疫學研究的一大熱點。 近期的研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞表面存在識別靶細胞表面分子的活化受體和抑制性受體，NK細胞的效應功能取決于活化信號與抑制性信號的綜

3、合。抑制性受體能特異性識別靶細胞表面的MHCⅠ類分子并保護正常細胞不被殺傷，人的NK細胞抑制性受體主要有殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killercellIg-likereceptors，KIR)和凝集素樣受體CD94/NKG2A，在調(diào)節(jié)NK細胞功能方面起重要作用?；罨荏w識別經(jīng)典、非經(jīng)典的MHCⅠ類分子或MHCⅠ類相關(guān)分子，在NK活化的啟動方面起關(guān)鍵作用，其中尤為引人注目的是NKG2D，NKG2D的配基為非經(jīng)典的MHC樣分子MICA(MH

4、CclassⅠchain-relatedA)、MICB(MHCclassⅠchain-relatedB)及ULBP(UL16-bindingprotein)，這些分子在許多上皮及非上皮來源的腫瘤細胞、病毒感染細胞和受到“應激性刺激”的細胞均有表達或上調(diào)。研究表明，NKG2D的單獨活化即足以刺激NK細胞的活化，并能克服抑制性受體的強勢信號，因此，在NK細胞活化過程中起著舉足輕重的作用。而NKG2D配體的表達水平，可能決定著NKG2D的活化

5、與否。 目前世界上有六株細胞系被確認具有典型NK細胞標志，它們是：YT、NK-92、NKL、HANK-1、KHYG-1和NK-YS。這些細胞系的免疫表型為CD1-CD2+CD3-CD4-CD5-CD7+CD8。CD16-CD56+CD57-，具有NK活性，有/無ADCC效應。在這些細胞系中，YT細胞，來自一急性淋巴母細胞淋巴瘤和和胸腺瘤患者，1985年建系，為IL-2非依賴或低依賴細胞系，具有NK細胞的典型表面標志，但由于長期在

6、實驗室傳代培養(yǎng)，只能檢測到NKG2B和NKG2D的mRNA表達，而不能檢測到其蛋白的表達。YT細胞相對于NK-92和NKL細胞而言，其殺傷活性相對較地低。該研究選用YT細胞作為NKG2B和NKG2D轉(zhuǎn)染細胞的受體，來探討NKG2B和NKG2D分子的作用機制。 方法:(1)NKG2B和NKG2D克隆載體的構(gòu)建。從NK細胞系NK-92細胞中經(jīng)RT-PCR技術(shù)獲得NKG2BcDNA和NKG2DcDNA，與pGEM-TEasy連接及轉(zhuǎn)化

7、大腸桿菌后，構(gòu)建NKG2B和NKG2D克隆載體，進行DNA序列測定;(2)NKG2B和NKG2D真核表達載體的構(gòu)建。應用限制性內(nèi)切酶將NKG2B和NKG2D基因從克隆載體上切下來，連接到熒光真核表達載體pEGFP-N1上，構(gòu)建pGEM-TEasy/NKG2B和pGEM-TEasy/NKG2D真核表達載體;(3)真核表達載體在CHO細胞中的表達及鑒定。將篩選出的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到

8、CHO細胞中，經(jīng)G418篩選，克隆，RT-PCR鑒定NKG2B和NKG2DmRNA的表達，熒光顯微鏡、WesternBlot和免疫組化方法鑒定NKG2B和NKG2D蛋白的表達;(4)真核表達載體轉(zhuǎn)染YT細胞及對YT細胞生物學功能影響。將pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D質(zhì)粒通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染到Y(jié)T細胞中，MTT方法檢測YT細胞轉(zhuǎn)染前后的增殖情況與對OMDA231、PG、Hep2和Raji腫瘤細胞的殺傷情況，RT-

9、PCR技術(shù)檢測殺傷相關(guān)分子中，抗病毒分子IFNγ、細胞增殖分子IL-2、溶膜分子perforin和誘導細胞凋亡分子家族TNF超家族(TNFα、Fas/FasL、TRAIL、TWEAK)的轉(zhuǎn)錄水平，并同時設置β-actin為RT-PCR系統(tǒng)的內(nèi)參照。 結(jié)果: 一、NKG2B和NKG2D全長cDNA的克隆提取新鮮培養(yǎng)的NK-92細胞的總RNA，取5ug總RNA為模板，以oligo(dT)為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應。然后用NKG2B

10、和NKG2D的特異引物進行PCR反應，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定和與pGEM-TEasy載體連接、酶切鑒定后測序，證實已獲得的cDNA為NKG2B和NKG2D的全長cDNA，結(jié)果與文獻報道一致。 二、pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D重組表達載體的構(gòu)建用PstⅠ和XhoⅠ從克隆載體pGEM-TEasy/NKG2B切下NKG2B片段，與經(jīng)相同雙酶切的pEGFP-N1質(zhì)粒進行粘端連接；同樣用EcoRⅠ和BamHⅠ從

11、克隆載體pGEM-TEasy/NKG2D切下NKG2D片段，與經(jīng)相同雙酶切的pEGFP-N1質(zhì)粒進行粘端連接。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌HB101，利用PCR篩選陽性克隆，提取純化PCR陽性重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建好的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D重組表達載體。 三、NKG2B和NKG2D在CHO細胞中的表達應用脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的pEGFP-N1/NKG2B和pEGF

12、P-N1/NKG2D重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO細胞，G418篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑選抗性克隆，RT-PCR鑒定mRNA的表達，熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光發(fā)出、WesternBlot和免疫組化方法鑒定蛋白的表達。結(jié)果顯示構(gòu)建的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)染CHO細胞并且有NKG2B和NKG2D的蛋白表達。 四、NKG2B和NKG2D真核表達載體轉(zhuǎn)染YT細胞及對其生物學功能影響應用脂質(zhì)體法將構(gòu)建

13、好的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染YT細胞，MTT方法測定轉(zhuǎn)染前后的細胞增殖效應和對OMDA231、PG、Hep2和Raji腫瘤細胞的殺傷情況，RT-PCR技術(shù)檢測殺傷功能相關(guān)分子的變化。結(jié)果顯示YT細胞轉(zhuǎn)染前后增殖效應沒有變化；NKG2B轉(zhuǎn)染YT細胞后對OMDA231、PG、Hep2細胞殺傷活性無變化，而對Raji有增強作用，殺傷相關(guān)分子IFNγ、FasL、TRAIL有明顯降低。NKG2

14、D轉(zhuǎn)染YT細胞后對OMDA231、PG、Hep2和Raji細胞殺傷活性均有增強作用，殺傷相關(guān)分子IFNγ、IL-2、TNFα、Perforin、TWEAK有明顯增強。 結(jié)論: (1)通過基因工程技術(shù)獲得了全長的NKG2B和NKG2D基因片段，并且測序正確，成功構(gòu)建了pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D真核表達載體。 (2)經(jīng)轉(zhuǎn)染CHO細胞后，能夠在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，RT-PCR檢測出

15、mRNA的表達，WesternBlot和免疫組化方法鑒定蛋白的表達。 (3)轉(zhuǎn)染YT細胞，轉(zhuǎn)染前后增殖效應沒有變化；NKG2B轉(zhuǎn)染YT細胞后對OMDA231、PG、Hep2細胞殺傷活性無變化，而殺傷相關(guān)分子IFNγ、FasL、TRAIL有明顯降低。NKG2D轉(zhuǎn)染YT細胞后對OMDA231、PG、Hep2和Raji細胞殺傷活性均有增強作用，殺傷相關(guān)分子IFNγ、IL-2、TNFα、Pefforin、TWEAK有明顯增強。